人低氧誘導(dǎo)因子-1α ELISA 試劑盒
【產(chǎn)品名稱】
中文名稱：人低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）酶聯(lián)免疫試劑盒（ELISA）
英文名稱： Human hypoxia-inducible factor 1α（HIF-1α） ELISA KIT
【包裝規(guī)格】
48人份/盒,，96人份/盒
【預(yù)期用途】
定量檢測血清,、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清和組織等樣本中的人低氧誘導(dǎo)因子-1α （HIF-1α）濃度,。
1. 檢測原理
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。在預(yù)包被抗人低氧誘導(dǎo)因子-1α
（HIF-1α）抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中,，加入人低氧誘導(dǎo)因子-1α （HIF-1α）標(biāo)準(zhǔn)品和
待測樣本，再加入另一株HRP標(biāo)記的抗人低氧誘導(dǎo)因子-1α （HIF-1α）抗體（HRP標(biāo)記抗體）,，
經(jīng)過溫育與充分洗滌,，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-HRP標(biāo)記抗體的
夾心復(fù)合物,。加入顯色底物A和B,，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物,，在終止液（2M 硫酸）作用
下,，最終轉(zhuǎn)化為黃色。在酶標(biāo)儀450nm波長上測定吸光度（OD值）,，吸光度（OD值）與待測樣品中
人低氧誘導(dǎo)因子-1α （HIF-1α）的濃度正相關(guān),。擬合標(biāo)準(zhǔn)品曲線，可以計算出樣本中人低氧誘
導(dǎo)因子-1α （HIF-1α）的濃度,。
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2. 試劑盒檢測的局限
1）僅供科研使用,，不得用于臨床診斷
2）請在本試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用。
3）試劑盒的試劑不能與其他批號的試劑或其他來源的試劑混合使用,。
4）任何操作人員,、移液技術(shù)、洗滌技術(shù),、孵育溫度,、試劑盒保存時間的改變，都將影響結(jié)合反
應(yīng),。
5）本試劑盒在設(shè)計上去除或降低了生物學(xué)樣本中的一些內(nèi)源性干擾因素,，并非所有可能的影響因
素都已經(jīng)去除。
1. 試劑盒提供的材料
備注：
1）標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：64,、 32,、 16、 8,、 4,、 2 pg/mL。
2）經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗,，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi),，實驗過程中直接取
50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時,，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀
釋后再進(jìn)行實驗,。
3）盒子拆封后必須在一個月內(nèi)使用完；試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染；相關(guān)試劑在
分裝時會比標(biāo)簽上標(biāo)明的體積稍多一些,，具體含量以實際收到的實物為主,。3
2. 未提供的材料設(shè)備
1）能夠檢測 450 nm 吸光度的酶標(biāo)儀
2）移液器及槍頭、加樣槽
3）3.37℃恒溫箱或水浴鍋
4）準(zhǔn)備試劑用的試管,、離心管,、量筒等
5）蒸餾水或去離子水
6）渦旋振蕩器、微孔板振蕩器
3.貯存
試劑盒保存于 2 - 8℃,，有效期標(biāo)注于標(biāo)簽上（有效期一般是6個月）,。只有恰當(dāng)保存的試
劑才是有保證的。如果試劑盒的組分需要再次使用,， 請確保上一次使用之后沒有被污染,。
未開封試劑盒
貯存于 2 - 8℃。
請在有效期內(nèi)使用,。
打開的
試劑盒
或重組
試劑
顯色底物A
顯色底物B
終止液
20×洗液
樣本稀釋液
在 2 - 8℃，
大約可以貯存 3個月,。
標(biāo)準(zhǔn)品
HRP 標(biāo)記抗體
在 2 - 8℃,，大約可貯存 14天。
使用后丟棄,。
預(yù)包被酶標(biāo)板
未使用的板條請放回鋁箔袋,，封好封
口。在 2 - 8℃,，大約可貯存 1 4天,。
4.注意事項
1）所有的化學(xué)試劑理應(yīng)被認(rèn)為具有潛在危害。
2）推薦只有經(jīng)過良好實驗室培訓(xùn)的工作人員方可操作本試劑盒,。操作時請佩戴合適的防護(hù)設(shè)
施,，例如白大衣、乳膠手套,、安全眼鏡等,。3）請避免試劑接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸,，請立即用大量清水清洗,。
4）試劑盒中的終止液為酸性溶液，在使用終止液時,，請佩戴防護(hù)服,，及防護(hù)眼睛、手及面部的設(shè)
施,。
5）本試劑盒用于科學(xué)研究,，不能用于診斷治療。
6）請不要使用過期的試劑。
7)在試劑盒的貯存或孵育過程請避免強(qiáng)光照射,。
8)在操作試劑盒或處理樣本時請佩戴乳膠或一次性手套,。
9)為了避免微生物的污染，以及試劑與樣本間的交叉污染,，請使用一次性槍頭,。
10)使用干凈的容器配制試劑。
11)試劑的準(zhǔn)備必須使用蒸餾水或去離子水,。
12)顯色底物在使用之前必須平衡至室溫,。
13)液體廢棄物的處理。不含酸的液體廢棄物,，加入 1.0 %的次氯酸鈉,，浸泡 30 分鐘。含酸的
液體廢棄物,，請先中和,， 再加入次氯酸鈉。
5.技術(shù)要點
1)加校準(zhǔn)品與樣本時,，每個校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭,，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避
免交叉污染,。
2)在應(yīng)用自動洗板機(jī)時,，加入洗液之后，設(shè)置 30 秒的浸泡程序,，或者在不同的洗滌步驟將微
孔板掉轉(zhuǎn) 180 度,，這樣可以提高分析的準(zhǔn)確度。
3)為保證結(jié)果的精確性,，孵育時封好封板膜,。
4)顯色底物在添加之前應(yīng)是無色的。保持顯色底物始終處于避光態(tài),。
5)終止液的添加順序應(yīng)與顯色底物的添加順序相同,。
6)添加終止液之后，底物的顏色應(yīng)由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色,。如果底物呈現(xiàn)綠色,，說明終止液與顯色底
物沒有充分混勻。
7）在任何情況下,，避免接觸微孔板的內(nèi)表面,。
8）實驗中，用剩的板條,，應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存,。
三、檢測準(zhǔn)備與步驟
1.樣本采集與貯存
細(xì)胞培養(yǎng)上清
2000 × g條件下離心20m分鐘,，去除細(xì)胞顆粒和聚合物,，上清液保存在- 20℃以下，避免反
4復(fù)凍融,。
血清樣本
離心管收集血清,。血樣凝集 30 分鐘后，2000 × g 離心 10 分鐘,。吸取血清樣本之后即刻
檢測,，或者分裝，-20℃以下貯存,，避免反復(fù)凍融,。
血漿樣本
EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝收集血漿樣本,。2000 × g 離心 20 分鐘收集樣本,。即刻檢測，
或者分裝,，-20℃以下貯存,，避免反復(fù)凍融。
組織樣本
用預(yù)冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組
織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對應(yīng)9 mL的PBS，具體體積可
根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整,，并做好記錄,。推 薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在
冰上充分研磨,。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,，可以對勻 漿液進(jìn)行超聲破碎或反復(fù)凍融。最后將勻
漿液5000×g離心 5-10分鐘,，取上清檢測,。
細(xì)胞提取液樣本
貼壁細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋BAI酶消化,，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞,；懸浮
細(xì) 胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS 洗滌3次,。每 1×106 個細(xì)胞中加入150-200μL
PBS重懸并通過反 復(fù)凍融使細(xì)胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積),。將提取液于1500×g離心
10分鐘,，取上清檢測。
注意：1）避免樣本的反復(fù)凍融,，在檢測前,，冷凍樣本應(yīng)緩慢地恢復(fù)至室溫，輕柔混勻,。
2）本試劑盒可能適用于其它生物學(xué)樣本,，但是未充分驗證。
2.試劑準(zhǔn)備
1）用前,，所有的組分都要至少復(fù)溫30min,，確保充分復(fù)溫到室溫。
2）濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液,，會有結(jié)晶產(chǎn)生,，這屬于正常現(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)
晶*溶解,。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋,，即1份的濃縮洗滌液,，添加19份的蒸餾水。
3.檢測步驟
51）試劑,、樣本平衡：檢測之前請將所有的試劑,、樣本平衡至室溫，標(biāo)準(zhǔn)品,、質(zhì)控品和樣品,，建議
做復(fù)孔。
配置工作液：按前面試劑準(zhǔn)備中描述的方法,，配制好試劑盒各種組分的工作液,。
2）加標(biāo)準(zhǔn)品、樣本：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔,、樣本孔和空白孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，
樣本孔加待測樣本50μL,，空白孔不加,。
3）加 HRP標(biāo)記抗體：除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體
100μL,。
4）孵育：使用封板膜封板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60分鐘,。
5）洗滌：棄掉液體,，每孔加入300μL洗液洗板,，靜置20s，洗滌5次,。每次洗板,，在吸水紙上拍
干。為獲得理想的實驗性能,，必須*移除殘留液體,。
6）加底物顯色：每孔加入50μL顯色底物A、B 各50μL,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15分鐘,。
7）加終止液：每孔加入50μL終止液。顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色,。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化
明顯不均勻,，請輕輕叩擊板框，充分混勻,。
8）檢測讀數(shù)：在 15分鐘之內(nèi),，使用450nm酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測讀數(shù)。
4.廢物處理
所有使用或未使用的試劑,，所有污染性的一次性材料,，應(yīng)當(dāng)遵循傳染性或潛在傳染性產(chǎn)品
的處理程序，每個實驗室都有責(zé)任根據(jù)其實驗的類型和危險性級別,，進(jìn)行廢物和污物的處理,，
同時要嚴(yán)格依照有關(guān)規(guī)定對待所有的廢物和污物。
四,、分析
1.結(jié)果計算
1）復(fù)孔的值通常在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效,，復(fù)孔平均值可作為測量值。
2）每個標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度值應(yīng)減去本底校正孔的吸光度值(如果沒有做校正孔,，則不需要減
去)。
3）檢測完成后,，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為縱坐標(biāo),，對應(yīng)的吸光度（OD值）作為橫坐標(biāo)，利用計算機(jī)軟
件,，采用多項式曲線擬合,，創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值）,，利用方程計算樣品的
濃度值,。
4）如果樣品被稀釋，通過上述方法測的的濃度值,，要乘以稀釋倍數(shù),，才是樣品的最終濃度,。
（示意圖，僅供參考）
2.試劑盒的性能
1）物理性能
試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明,、無沉淀或者絮狀物,。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無破損漏氣,。
2)劑量反應(yīng)曲線線性
標(biāo)準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值,，大于等于0.99。
3)精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高,、中,、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估,。批內(nèi)變異系
數(shù)CV%小于8%,。
批間精密度：三組已知的高、中,、低濃度樣品,，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。批間變異系
數(shù)CV%小于12%,。
4）檢測范圍
2 pg/mL – 64 pg/mL
5)靈敏度
可檢測濃度為0.1 pg/mL,。
6)特異性
本試劑盒識別天然和重組人低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）。
7)穩(wěn)定性
2℃-8℃保存,，有效期6個月,。說明
由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒
定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險,。
1. 最終的實驗結(jié)果與試劑的有效性,、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必準(zhǔn)
備充足的標(biāo)本備份,。
2. 不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別,，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等,，請依據(jù)試劑盒
內(nèi)說明書進(jìn)行實驗操作,，網(wǎng)站電子版說明書僅作參考。
3. 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果,，不能混用其他制造商的產(chǎn)品,。只有嚴(yán)格遵
守本試劑盒的實驗說明才會得到最佳的檢測結(jié)果。
4. 本公司只對試劑盒本身負(fù)責(zé),，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé),，請使用者使用前充
分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本,。
5. 使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致ELISA實驗
結(jié)果偏差,。
6. 若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清,，因該類樣本干擾因素較多，如：細(xì)胞狀態(tài),、細(xì)胞數(shù)量,、采樣時間等，
所以可能存在檢測不出的情況,。
7. 某些天然蛋白或重組蛋白,，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及
捕獲抗體不匹配,，而不被檢測出,。
人低氧誘導(dǎo)因子-1α ELISA 試劑盒
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