人低氧誘導(dǎo)因子-1α ELISA 試劑盒
【產(chǎn)品名稱(chēng)】
中文名稱(chēng)：人低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）酶聯(lián)免疫試劑盒（ELISA）
英文名稱(chēng)： Human hypoxia-inducible factor 1α（HIF-1α） ELISA KIT
【包裝規(guī)格】
48人份/盒,，96人份/盒
【預(yù)期用途】
定量檢測(cè)血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清和組織等樣本中的人低氧誘導(dǎo)因子-1α （HIF-1α）濃度,。
1. 檢測(cè)原理
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,。在預(yù)包被抗人低氧誘導(dǎo)因子-1α
（HIF-1α）抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中,，加入人低氧誘導(dǎo)因子-1α （HIF-1α）標(biāo)準(zhǔn)品和
待測(cè)樣本,，再加入另一株HRP標(biāo)記的抗人低氧誘導(dǎo)因子-1α （HIF-1α）抗體（HRP標(biāo)記抗體），
經(jīng)過(guò)溫育與充分洗滌,，去除未結(jié)合的組分,，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-HRP標(biāo)記抗體的
夾心復(fù)合物。加入顯色底物A和B,，底物在HRP催化下,，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫酸）作用
下,，最終轉(zhuǎn)化為黃色,。在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)上測(cè)定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測(cè)樣品中
人低氧誘導(dǎo)因子-1α （HIF-1α）的濃度正相關(guān),。擬合標(biāo)準(zhǔn)品曲線,，可以計(jì)算出樣本中人低氧誘
導(dǎo)因子-1α （HIF-1α）的濃度。
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2. 試劑盒檢測(cè)的局限
1）僅供科研使用,，不得用于臨床診斷
2）請(qǐng)?jiān)诒驹噭┖袠?biāo)示的有效期內(nèi)使用,。
3）試劑盒的試劑不能與其他批號(hào)的試劑或其他來(lái)源的試劑混合使用。
4）任何操作人員,、移液技術(shù),、洗滌技術(shù)、孵育溫度,、試劑盒保存時(shí)間的改變,，都將影響結(jié)合反
應(yīng)。
5）本試劑盒在設(shè)計(jì)上去除或降低了生物學(xué)樣本中的一些內(nèi)源性干擾因素,，并非所有可能的影響因
素都已經(jīng)去除,。
1. 試劑盒提供的材料
備注：
1）標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：64、 32,、 16、 8,、 4,、 2 pg/mL,。
2）經(jīng)過(guò)大量正常標(biāo)本檢驗(yàn)，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測(cè)范圍內(nèi),，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中直接取
50μL樣本上樣即可,。當(dāng)有部分樣本值超過(guò)最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí)，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀
釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。
3）盒子拆封后必須在一個(gè)月內(nèi)使用完,；試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染；相關(guān)試劑在
分裝時(shí)會(huì)比標(biāo)簽上標(biāo)明的體積稍多一些,，具體含量以實(shí)際收到的實(shí)物為主,。3
2. 未提供的材料設(shè)備
1）能夠檢測(cè) 450 nm 吸光度的酶標(biāo)儀
2）移液器及槍頭、加樣槽
3）3.37℃恒溫箱或水浴鍋
4）準(zhǔn)備試劑用的試管,、離心管,、量筒等
5）蒸餾水或去離子水
6）渦旋振蕩器、微孔板振蕩器
3.貯存
試劑盒保存于 2 - 8℃,，有效期標(biāo)注于標(biāo)簽上（有效期一般是6個(gè)月）,。只有恰當(dāng)保存的試
劑才是有保證的。如果試劑盒的組分需要再次使用,， 請(qǐng)確保上一次使用之后沒(méi)有被污染,。
未開(kāi)封試劑盒
貯存于 2 - 8℃。
請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)使用,。
打開(kāi)的
試劑盒
或重組
試劑
顯色底物A
顯色底物B
終止液
20×洗液
樣本稀釋液
在 2 - 8℃,，
大約可以貯存 3個(gè)月。
標(biāo)準(zhǔn)品
HRP 標(biāo)記抗體
在 2 - 8℃,，大約可貯存 14天,。
使用后丟棄。
預(yù)包被酶標(biāo)板
未使用的板條請(qǐng)放回鋁箔袋,，封好封
口,。在 2 - 8℃，大約可貯存 1 4天,。
4.注意事項(xiàng)
1）所有的化學(xué)試劑理應(yīng)被認(rèn)為具有潛在危害,。
2）推薦只有經(jīng)過(guò)良好實(shí)驗(yàn)室培訓(xùn)的工作人員方可操作本試劑盒。操作時(shí)請(qǐng)佩戴合適的防護(hù)設(shè)
施,，例如白大衣,、乳膠手套,、安全眼鏡等。3）請(qǐng)避免試劑接觸皮膚和眼睛,。如不慎接觸，請(qǐng)立即用大量清水清洗,。
4）試劑盒中的終止液為酸性溶液,，在使用終止液時(shí),，請(qǐng)佩戴防護(hù)服,，及防護(hù)眼睛、手及面部的設(shè)
施,。
5）本試劑盒用于科學(xué)研究，不能用于診斷治療,。
6）請(qǐng)不要使用過(guò)期的試劑,。
7)在試劑盒的貯存或孵育過(guò)程請(qǐng)避免強(qiáng)光照射,。
8)在操作試劑盒或處理樣本時(shí)請(qǐng)佩戴乳膠或一次性手套,。
9)為了避免微生物的污染，以及試劑與樣本間的交叉污染,，請(qǐng)使用一次性槍頭。
10)使用干凈的容器配制試劑,。
11)試劑的準(zhǔn)備必須使用蒸餾水或去離子水,。
12)顯色底物在使用之前必須平衡至室溫,。
13)液體廢棄物的處理,。不含酸的液體廢棄物，加入 1.0 %的次氯酸鈉,，浸泡 30 分鐘,。含酸的
液體廢棄物,，請(qǐng)先中和,， 再加入次氯酸鈉。
5.技術(shù)要點(diǎn)
1)加校準(zhǔn)品與樣本時(shí),，每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應(yīng)該懸臂加樣,，避
免交叉污染。
2)在應(yīng)用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí),，加入洗液之后，設(shè)置 30 秒的浸泡程序,，或者在不同的洗滌步驟將微
孔板掉轉(zhuǎn) 180 度,，這樣可以提高分析的準(zhǔn)確度。
3)為保證結(jié)果的精確性,，孵育時(shí)封好封板膜,。
4)顯色底物在添加之前應(yīng)是無(wú)色的。保持顯色底物始終處于避光態(tài),。
5)終止液的添加順序應(yīng)與顯色底物的添加順序相同。
6)添加終止液之后,，底物的顏色應(yīng)由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。如果底物呈現(xiàn)綠色,，說(shuō)明終止液與顯色底
物沒(méi)有充分混勻,。
7）在任何情況下，避免接觸微孔板的內(nèi)表面,。
8）實(shí)驗(yàn)中，用剩的板條,，應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存。
三,、檢測(cè)準(zhǔn)備與步驟
1.樣本采集與貯存
細(xì)胞培養(yǎng)上清
2000 × g條件下離心20m分鐘,，去除細(xì)胞顆粒和聚合物,，上清液保存在- 20℃以下，避免反
4復(fù)凍融,。
血清樣本
離心管收集血清。血樣凝集 30 分鐘后,，2000 × g 離心 10 分鐘,。吸取血清樣本之后即刻
檢測(cè)，或者分裝,，-20℃以下貯存，避免反復(fù)凍融,。
血漿樣本
EDTA,、枸櫞酸鈉或肝素抗凝收集血漿樣本。2000 × g 離心 20 分鐘收集樣本,。即刻檢測(cè),，
或者分裝，-20℃以下貯存,，避免反復(fù)凍融,。
組織樣本
用預(yù)冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液,，稱(chēng)重后將組織剪碎,。將剪碎的組
織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9 mL的PBS,，具體體積可
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,，并做好記錄。推 薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,，在
冰上充分研磨,。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻 漿液進(jìn)行超聲破碎或反復(fù)凍融,。最后將勻
漿液5000×g離心 5-10分鐘,，取上清檢測(cè),。
細(xì)胞提取液樣本
貼壁細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋BAI酶消化,，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞,；懸浮
細(xì) 胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS 洗滌3次,。每 1×106 個(gè)細(xì)胞中加入150-200μL
PBS重懸并通過(guò)反 復(fù)凍融使細(xì)胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心
10分鐘,，取上清檢測(cè),。
注意：1）避免樣本的反復(fù)凍融，在檢測(cè)前,，冷凍樣本應(yīng)緩慢地恢復(fù)至室溫,，輕柔混勻。
2）本試劑盒可能適用于其它生物學(xué)樣本,，但是未充分驗(yàn)證,。
2.試劑準(zhǔn)備
1）用前，所有的組分都要至少?gòu)?fù)溫30min,，確保充分復(fù)溫到室溫,。
2）濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會(huì)有結(jié)晶產(chǎn)生,，這屬于正常現(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)
晶*溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水,，按1:20稀釋?zhuān)?份的濃縮洗滌液,，添加19份的蒸餾水,。
3.檢測(cè)步驟
51）試劑、樣本平衡：檢測(cè)之前請(qǐng)將所有的試劑,、樣本平衡至室溫，標(biāo)準(zhǔn)品,、質(zhì)控品和樣品,，建議
做復(fù)孔,。
配置工作液：按前面試劑準(zhǔn)備中描述的方法,，配制好試劑盒各種組分的工作液,。
2）加標(biāo)準(zhǔn)品、樣本：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔,、樣本孔和空白孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，
樣本孔加待測(cè)樣本50μL,，空白孔不加,。
3）加 HRP標(biāo)記抗體：除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體
100μL,。
4）孵育：使用封板膜封板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60分鐘,。
5）洗滌：棄掉液體,，每孔加入300μL洗液洗板，靜置20s,，洗滌5次,。每次洗板，在吸水紙上拍
干,。為獲得理想的實(shí)驗(yàn)性能,，必須*移除殘留液體。
6）加底物顯色：每孔加入50μL顯色底物A,、B 各50μL,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15分鐘。
7）加終止液：每孔加入50μL終止液,。顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色,。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化
明顯不均勻,，請(qǐng)輕輕叩擊板框，充分混勻,。
8）檢測(cè)讀數(shù)：在 15分鐘之內(nèi),，使用450nm酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)讀數(shù)。
4.廢物處理
所有使用或未使用的試劑,，所有污染性的一次性材料,，應(yīng)當(dāng)遵循傳染性或潛在傳染性產(chǎn)品
的處理程序，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有責(zé)任根據(jù)其實(shí)驗(yàn)的類(lèi)型和危險(xiǎn)性級(jí)別,，進(jìn)行廢物和污物的處理,，
同時(shí)要嚴(yán)格依照有關(guān)規(guī)定對(duì)待所有的廢物和污物。
四,、分析
1.結(jié)果計(jì)算
1）復(fù)孔的值通常在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效,，復(fù)孔平均值可作為測(cè)量值。
2）每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度值應(yīng)減去本底校正孔的吸光度值(如果沒(méi)有做校正孔,，則不需要減
去),。
3）檢測(cè)完成后，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為縱坐標(biāo),，對(duì)應(yīng)的吸光度（OD值）作為橫坐標(biāo)，利用計(jì)算機(jī)軟
件,，采用多項(xiàng)式曲線擬合,，創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過(guò)樣本的吸光度（OD值）,，利用方程計(jì)算樣品的
濃度值,。
4）如果樣品被稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)上述方法測(cè)的的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù),，才是樣品的最終濃度,。
（示意圖，僅供參考）
2.試劑盒的性能
1）物理性能
試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明,、無(wú)沉淀或者絮狀物,。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無(wú)破損漏氣,。
2)劑量反應(yīng)曲線線性
標(biāo)準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值,，大于等于0.99。
3)精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高,、中,、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估,。批內(nèi)變異系
數(shù)CV%小于8%,。
批間精密度：三組已知的高,、中、低濃度樣品,，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估,。批間變異系
數(shù)CV%小于12%。
4）檢測(cè)范圍
2 pg/mL – 64 pg/mL
5)靈敏度
可檢測(cè)濃度為0.1 pg/mL,。
6)特異性
本試劑盒識(shí)別天然和重組人低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）,。
7)穩(wěn)定性
2℃-8℃保存，有效期6個(gè)月,。說(shuō)明
由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒
定與分析,，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。
1. 最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性,、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān),，請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)
備充足的標(biāo)本備份。
2. 不同批次的同一產(chǎn)品可能會(huì)有少許差別,，如：檢測(cè)限,、靈敏度以及顯色時(shí)間等，請(qǐng)依據(jù)試劑盒
內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,，網(wǎng)站電子版說(shuō)明書(shū)僅作參考,。
3. 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測(cè)效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品,。只有嚴(yán)格遵
守本試劑盒的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明才會(huì)得到最佳的檢測(cè)結(jié)果,。
4. 本公司只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé),，請(qǐng)使用者使用前充
分考慮到樣本的可能使用量,，預(yù)留充足的樣本。
5. 使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會(huì)由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致ELISA實(shí)驗(yàn)
結(jié)果偏差,。
6. 若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清,，因該類(lèi)樣本干擾因素較多，如：細(xì)胞狀態(tài),、細(xì)胞數(shù)量,、采樣時(shí)間等，
所以可能存在檢測(cè)不出的情況,。
7. 某些天然蛋白或重組蛋白,，包括原核及真核重組蛋白，可能因?yàn)榕c本產(chǎn)品所使用的檢測(cè)抗體及
捕獲抗體不匹配,，而不被檢測(cè)出,。
人低氧誘導(dǎo)因子-1α ELISA 試劑盒
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