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吸光度測量基礎(chǔ)知識

紫外-可見光吸光度測量長期以來一直是生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室中定量純化生物分子的標(biāo)準(zhǔn)方法,。該方法允許根據(jù)分子在特定波長下的吸光度曲線快速檢測分子。

吸光度還提供樣品污染的指示,。吸光度光譜的形狀將根據(jù)其他分子的存在而變化,，這些分子的吸收波長與目標(biāo)分子相同或接近相同波長。

熒光定量基礎(chǔ)知識

熒光團(tuán)是吸收一個波長（激發(fā)波長）的光并發(fā)射另一個波長（發(fā)射波長）的光的分子,。某些熒光團(tuán)的結(jié)構(gòu)只有在與特定分子（例如雙鏈 DNA）結(jié)合時才能發(fā)出熒光,。熒光檢測利用這種結(jié)合特異性來建立樣品發(fā)射的熒光量與溶液中目標(biāo)生物分子濃度之間的直接關(guān)聯(lián)。

通過將熒光基團(tuán)與已知濃度的樣品混合并測量相對熒光單位 （RFU）,，可以繪制濃度與測得的 RFU 之間的關(guān)系,，并將其用作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后可以將與未知樣品結(jié)合的相同熒光團(tuán)的發(fā)射光與該標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖,，以確定樣品濃度,。

比較吸光度和熒光結(jié)果

在比較基于吸光度的方法和基于熒光的方法的結(jié)果時，重要的是要考慮每種方法的特異性,。例如,，在 260 nm 處的吸光度測量對 dsDNA 沒有選擇性，因?yàn)?ssDNA 和 RNA 也在 260 nm 處吸收,。在 260 nm 處的任何吸光度測量都是對樣品中所有核酸和存在的任何污染物（包括蛋白質(zhì)）的測量,。這適用于所有類型的測量，而不僅僅是核酸,。因此,，吸光度法非常適合測量純樣品。

相比之下,，熒光檢測對給定的分析物具有高度特異性,，包括但不限于 dsDNA、ssDNA,、RNA 或蛋白質(zhì),。通常，通過吸光度測量的樣品濃度大于通過熒光方法測量的濃度,。