二抗用于多種免疫測定中,，以檢測一抗的存在。這些抗體與酶,、生物分子或熒光染料偶聯(lián),，以便檢測一抗。與一抗不同,，二抗針對一抗的物種和同種型產(chǎn)生,，并通過在多個位點與一抗結(jié)合來檢測一抗。
要成功選擇二抗,，應(yīng)考慮以下因素：
確保良好匹配 – 宿主物種是產(chǎn)生二抗的動物,，應(yīng)始終與一抗的宿主不同。例如,，如果您使用在兔子中產(chǎn)生的一抗,，您將需要在兔子以外的其他物種（如山羊、驢或小鼠）中產(chǎn)生的抗兔二抗（圖 1）,。
圖 1：二抗機制,。
完整的抗體還是片段？ – 實際上,，真正的問題是“您的一抗是單克隆還是多克?。窟@兩個問題的答案通常取決于應(yīng)用程序,。單克隆一抗包含免疫球蛋白的單一同種型,。因此，使用特異性識別該同種型的二抗至關(guān)重要,。此外,，單克隆抗體通常在小鼠、兔子和大鼠中產(chǎn)生,。因此,，如果一抗是小鼠 IgG1,，您將需要抗小鼠 IgG 或特異性較低的 F（ab） 片段抗小鼠 IgG?？贵w片段適合免疫組化和免疫熒光,，因為它們體積較小且能夠穿透組織。然而,，較小的尺寸可能會限制與片段偶聯(lián)的染料或酶的選擇,，從而導致二抗的靈敏度可能不如全抗體選擇。
多克隆一抗包含免疫球蛋白 G 的幾種同種型的混合物,。因此,，為了最大限度地檢測靶標，最好使用可識別所有同種型的二抗,。多克隆抗體通常在兔,、山羊、綿羊和驢中以全抗體形式（重鏈 + 輕鏈）飼養(yǎng),，因此必須用來自不同物種的 IgG 庫對二級宿主物種進行免疫,，從而使純化的二抗能夠識別所有形式。例如,，如果一抗多克隆抗體是山羊 IgG,，則需要抗山羊 IgG （H+L）。然而,，全抗體會導致高背景和低特異性,，因為輕鏈由所有免疫球蛋白共享，這會增加交叉反應(yīng)性（圖 2）,。
圖 2：免疫測定中全 IgG 二抗與片段化二抗的結(jié)合機制,。
根據(jù)您的應(yīng)用選擇偶聯(lián)物 - 這取決于二抗如何檢測信號。例如,，免疫組織化學,、ELISA 和蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用使用基于生物素標記的比色和化學發(fā)光檢測來放大信號并提高靈敏度,，以及與辣根過氧化物酶 （HRP） 或堿性磷酸酶 （AP） 起作用的酶促反應(yīng),。然而，對于免疫標記,、熒光顯微鏡和流式細胞術(shù)實驗,，使用熒光染料（如 Alexa Fluor）檢測信號，這些染料直接與抗體偶聯(lián)以放大信號和靈敏度,。
親和純化抗體與交叉吸附抗體 – 此步驟用于提高抗體的特異性,，并且可以在親和純化和交叉吸附方面進行區(qū)分。大多數(shù)二抗通過親和層析進行純化,，從而產(chǎn)生高親和力抗體,。這種抗體通常用于 IHC,，因為它們提供最小的非特異性結(jié)合，也可用于 western blot 以檢測低豐度蛋白質(zhì),。交叉吸附的二抗通常會經(jīng)過額外的純化步驟,，以過濾掉與脫靶免疫球蛋白種類結(jié)合的成員。此步驟增加了它們的特異性并降低了非特異性背景,。這些抗體專為免疫組織化學等特定應(yīng)用而設(shè)計,。
總之，二抗的選擇取決于手頭的應(yīng)用,、靶標豐度所需的靈敏度和純化水平,，以及非特異性結(jié)合的風險。如果您想討論上述方法,，歡迎隨時聯(lián)系,！
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