差異蛋白質(zhì)組學(xué)可以比較來(lái)自不同生物來(lái)源的大量蛋白質(zhì)。通常的例子是經(jīng)過(guò)處理和未經(jīng)處理的細(xì)胞,、不同的細(xì)菌菌株,。即使蛋白質(zhì)譜中的微小差異也可以通過(guò)差異蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)發(fā)現(xiàn)。
Lumiprobe 3Dye 套件包含 Cyanine2,、Cyanine3 和 Cyanine5 染料,，它們的光譜不同，但遷移率匹配,。因此,，用這些染料標(biāo)記的蛋白質(zhì)在凝膠電泳中共同遷移。由于使用染料進(jìn)行的蛋白質(zhì)標(biāo)記依賴(lài)于 NHS 酯化學(xué),，因此賴(lài)氨酸殘基是標(biāo)記的主要位點(diǎn),。
二維蛋白質(zhì)組學(xué)的最佳實(shí)踐意味著使用合并的內(nèi)部對(duì)照樣本，該樣本本質(zhì)上是在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中分析的兩個(gè)樣本的混合物,。內(nèi)部對(duì)照樣品用 Cyanine2 標(biāo)記,，分析樣品用 Cyanine3 或 Cyanine5 標(biāo)記（這兩種染料可以互換）,。
3Dye 試劑以 5 nmol、10 nmol 和 25 nmol 包裝進(jìn)行預(yù)先測(cè)量,。染料被凍干以延長(zhǎng)其保質(zhì)期。每個(gè)包裝在使用前均應(yīng)用 DMF 重新配制,。 DMF 質(zhì)量對(duì)于實(shí)驗(yàn)和產(chǎn)品保質(zhì)期至關(guān)重要,。套件中的染料附帶 DMF。
蛋白質(zhì)混合物的制備是測(cè)定中變化最大,、要求最高的部分,。它超出了協(xié)議的范圍，因?yàn)椴煌臉悠沸枰浅２煌牧呀鈼l件才能獲得適合檢測(cè)的蛋白質(zhì)混合物,。本質(zhì)上,，被比較的兩個(gè)樣品應(yīng)該在相同的條件下裂解以獲得有意義的結(jié)果。一般來(lái)說(shuō),，如果實(shí)驗(yàn)需要裂解,，建議使用基于 CHAPS 的裂解溶液。
通過(guò)每 1 nmol 每種染料添加 1 μL DMF（來(lái)自試劑盒）,，制備每種染料的 1 mM 庫(kù)存溶液。這些溶液在 -20°C 下可穩(wěn)定保存三個(gè)月,。為了確保保質(zhì)期,，在打開(kāi)前將管干燥、全解凍,，在關(guān)閉前盡可能用惰性氣體吹掃,。
使用無(wú)胺緩沖液（NaHCO3、醋酸鹽）或 Tris 緩沖液將蛋白質(zhì)混合物 pH 調(diào)節(jié)至 8.5,。在單獨(dú)的小瓶中,，準(zhǔn)備三個(gè)用于標(biāo)記的蛋白質(zhì)樣品：(1) 第一個(gè)蛋白質(zhì)樣品，(2) 第二個(gè)蛋白質(zhì)樣品,，以及 (3) 兩者的混合物（合并的內(nèi)部對(duì)照）,。每個(gè)樣品中的蛋白質(zhì)濃度理想情況下應(yīng)為 5–10 mg/mL，但也可以使用低至 1 mg/mL 的濃度,。每次反應(yīng)取 50 μg 蛋白質(zhì),。
通過(guò)取等分的 1 mM 庫(kù)存溶液并用 DMF 稀釋至 0.4 mM 來(lái)制備染料工作溶液。
將 1 μL 工作染料溶液添加到反應(yīng)混合物中：Cyanine3 表示未處理,，Cyanine5 表示處理過(guò)（反之亦然）,，Cyanine2 表示合并的內(nèi)部對(duì)照。通過(guò)移入和移出混合每個(gè)反應(yīng),，并在黑暗中放置 30 分鐘,。
通過(guò)向每種溶液中添加 1 μL 10 mM 賴(lài)氨酸來(lái)停止反應(yīng)（試劑盒中不包含該試劑,，但該試劑很容易獲得）。
合并三個(gè)樣品并運(yùn)行 2D 凝膠,。
使用任何能夠檢測(cè) Cyanine2,、Cyanine3 和 Cyanine5 的成像儀進(jìn)行分析?？梢詮哪z上切下蛋白質(zhì)斑點(diǎn)并通過(guò)質(zhì)譜分析,。
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
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