ProteOrange 染料可以在聚丙烯酰胺凝膠中電泳后快速、輕松地可視化蛋白質(zhì)。 ProteOrange 是一種二苯乙烯型熒光團(tuán),，含有兩性離子片段,。在核酸、多糖和其他分子存在的情況下,，蛋白質(zhì)/十二烷基硫酸鈉膠束 (SDS) 選擇性地結(jié)合染料,。 ProteOrange 可有效對分子量為 6 kDa 及以上的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。在三個數(shù)量級覆蓋的濃度范圍內(nèi),，熒光信號與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系,。
ProteOrange 凝膠染色的靈敏度大約是考馬斯染色的十倍，但不如銀染色敏感,。對于 ProteOrange,，檢測限為每條帶 3 ng 蛋白質(zhì)（考馬斯的檢測限約為 30 ng，銀染的檢測限約為 0.5 ng）,。然而,，與銀染相比，ProteOrange 染色的方案要簡單得多,，因為它不需要洗滌,，也不需要標(biāo)準(zhǔn) SDS-PAGE 的固定。實驗流程需要 30-60 分鐘才能完成,，包括在含有染料的 7.5% 乙酸水溶液中孵育凝膠,，以及用 7.5% 乙酸短暫沖洗凝膠 30 秒。應(yīng)使用波長為 312-365 nm 的透射儀進(jìn)行可視化,。 ProteOrange 庫存溶液在室溫下避光保存,。
確保染料原液不含沉淀物。如果不是這種情況,，請將試劑在 70 °C 下保持幾分鐘,，直至沉淀物全溶解，然后搖動小瓶,。
準(zhǔn)備染料的工作溶液,。準(zhǔn)備的量取決于凝膠塊的大小和托盤尺寸。例如,，25 mL 的溶液足以制備 10 × 15 cm 的凝膠片,。要制備此溶液，請將 1.88 mL 冰醋酸溶解在 23 mL 水中,，制成 7.5% 乙酸,，并添加 5 μl 5000x ProteOrange 溶液。攪拌均勻,，避光保存不超過三小時,。
電泳結(jié)束后,，將凝膠放入托盤中，加入染料工作液,，避光孵育20-60分鐘（對于較薄的凝膠或較低百分比的凝膠,，應(yīng)縮短時間；對于1 mm的凝膠,，60分鐘最佳厚,，15% 凝膠）。染料的工作溶液只能使用一次,，因為重復(fù)使用會導(dǎo)致靈敏度降低,。
用 7.5% 乙酸溶液（不含染料）沖洗凝膠 30 秒。凝膠已準(zhǔn)備好進(jìn)行可視化,。
為了可視化,，將凝膠放在透照儀上。
要去除染料,，請將凝膠在 0.1% Tween 20 溶液中孵育 10-12 小時,，或用 7.5% 乙酸溶液反復(fù)清洗。
為了提高靈敏度,，我們建議在 TGB 緩沖液中添加 0.05% SDS（相對于標(biāo)準(zhǔn) 0.1%）進(jìn)行電泳。 SDS 濃度的這種變化不會影響蛋白質(zhì)的遷移率,，但會縮短染色時間,。
在含有甲醇/乙醇的溶液中染色之前不要固定凝膠。
對于小蛋白質(zhì)或低百分比凝膠,，應(yīng)選 10% 乙酸溶液,。
該染料不適用于將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上后對其進(jìn)行染色。
如果凝膠用于蛋白質(zhì)印跡,，ProteOrange 染色可以在標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液中進(jìn)行,，但這會導(dǎo)致靈敏度下降。
對于 Triton X-100 凝膠電泳,，電泳完成后立即在 Triton X100 不含 TGB 緩沖液中清洗凝膠（3×20 分鐘）,，然后不久將凝膠在添加了 0.05% SDS 的 TGB 緩沖液中孵育 30 分鐘，然后進(jìn)行染色,。
為了在電泳過程中對蛋白質(zhì)進(jìn)行染色,，ProteOrange 應(yīng)溶解在上層（陰極）緩沖液中。電泳結(jié)束后,，將凝膠在 7.5% 乙酸溶液中孵育 30 分鐘,，以降低熒光背景水平。
無需 SDS 即可對凝膠進(jìn)行染色,，但該方法的靈敏度會降低,，并且靈敏度很大程度上取決于蛋白質(zhì)的氨基酸組成,。除非電泳后應(yīng)回收天然蛋白質(zhì)，否則凝膠應(yīng)在含有 0.05% SDS 的緩沖液中孵育,，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行染色,。
通常，預(yù)染色的蛋白梯用 ProteOrange 進(jìn)一步染色時不會發(fā)出熒光,。僅使用未染色的梯子,。
用 ProteOrange、考馬斯染色或銀染色后仍然可以進(jìn)行,。
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