高質(zhì)量的組織制備對(duì)于高質(zhì)量的免疫組織化學(xué)結(jié)果絕對(duì)必要，因此始終值得花時(shí)間確保按照盡可能高的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行,，以避免令人失望的結(jié)果,。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，組織可能需要新鮮使用或固定,。
有時(shí)需要在進(jìn)一步處理或隨后的固定之前冷凍組織,。如果冷凍不當(dāng)，可能會(huì)形成冰晶,，損害細(xì)胞結(jié)構(gòu),。通過(guò)正確冷凍，這將保持組織的質(zhì)量,，從而最大限度地提高免疫染色成功的機(jī)會(huì),。
1. 將裝有異戊烷的燒杯（長(zhǎng)燒杯中至少 500ml）在 -80°C 中或使用干冰預(yù)冷至 -42°C 至 -45°C 之間。定期監(jiān)測(cè)溫度以確保溫度保持在這個(gè)范圍內(nèi),。
2. 在冰上使用干凈的工具解剖組織,。
3. 將紙巾放在鋁箔上，并用濾紙除去多余的液體,。
4. 將組織（不含鋁箔）輕輕浸入異戊烷中,。冷凍所需時(shí)間取決于組織樣本大小，但冷凍成年大鼠大腦大約需要 5 分鐘,。
5. 在從異戊烷中取出組織之前,，預(yù)冷鑷子。將冷凍組織放入裝有軟紙巾的預(yù)冷管中,。
6. 儲(chǔ)存于-80°C 直至下次使用,。
一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)動(dòng)物被灌注固定時(shí),，可以獲得最佳質(zhì)量的組織切片,。該過(guò)程涉及先用緩沖液然后用固定劑替換血液，并且其具有高自發(fā)熒光,。在嘗試之前,，請(qǐng)確保您的監(jiān)管制度涵蓋了這一點(diǎn),，并獲得經(jīng)驗(yàn)豐富的從業(yè)人員的培訓(xùn)。針對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物的一般方案是：
1. 通過(guò)適當(dāng)途徑過(guò)量注射麻醉劑,，直至動(dòng)物沒(méi)有腳趾捏和眨眼反射但心臟仍在跳動(dòng),。
2. 打開(kāi)胸腔，露出心臟,，剪斷右心房,。將針插入左心室，并通過(guò)冰冷的 PBS（大鼠約 200ml,，小鼠約 15ml）灌注,，然后灌注類(lèi)似體積的 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液。
3. 取出大腦/其他器官,，放入裝有 4% 多聚甲醛的小瓶中,，在 4°C 下放置 24 小時(shí)。
4. 將組織移入 4°C 含 30% 蔗糖的 PBS 中,，直至組織沉入小瓶底部
對(duì)于小體積的組織,，通常用固定劑孵育組織就足夠了,，而不是使用灌注固定,。然而，這將導(dǎo)致較高的背景,，因?yàn)檠翰粫?huì)從小毛細(xì)血管中去除,。
1. 在冰上用干凈的工具解剖組織。
2. 用冰冷的 PBS 短暫清洗
3. 將組織放入含 4% 多聚甲醛的 PBS 中,，4°C 下放置 24 小時(shí)
4. 將組織移入 4°C 含 30% 蔗糖的 PBS 中,，直至組織沉入小瓶底部
可以在一系列機(jī)器上切割切片，最常見(jiàn)的是低溫恒溫器和冷凍切片機(jī),。機(jī)器的選擇部分取決于可用性,，部分取決于需要切割多厚的部分。檢查可用機(jī)器的規(guī)格是否與所需的截面厚度相匹配,。
對(duì)于載玻片免疫組織化學(xué),，切片可以直接切割到顯微鏡載玻片上，或者切割到 PBS 中,，用于自由浮動(dòng)免疫組織化學(xué),。
切割后，切片可以冷凍以供日后處理：
載玻片安裝：讓切片干燥后,，切片可在 -20°C 至 -80°C 下保存長(zhǎng)達(dá)一年
自由浮動(dòng) 將切片轉(zhuǎn)移至冷凍保護(hù)劑中,，然后在 -20°C 下保存長(zhǎng)達(dá)一年。
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