金納米顆粒綴合物已廣泛應用于生物研究和生物傳感應用。例如,，金納米顆?？梢杂米鞴鈱W或電子顯微鏡、側流免疫測定和免疫印跡方案（例如斑點印跡和蛋白質印跡）中的探針,。
制備金綴合物有兩種方法，即被動吸附和通過連接體的共價偶聯(lián)。盡管制備過程相對簡單,，但蛋白質對金納米顆粒的被動吸附并不能提供涂層的附著,，因為隨著時間的推移，分子可能會從表面解吸,。此外,，在某些情況下，蛋白質在吸附到表面后會失去其特性,，這可能是由于三級結構的變化或活性位點/抗原結合位點與金表面的結合使其難以接近而引起的,。
盡管存在這些缺點，蛋白質被動吸附到金納米顆粒上仍然很受歡迎,，并且是生成蛋白質金綴合物的簡單方法,。通過被動吸附到標準球形金納米粒子來制備金納米粒子蛋白綴合物，可以使用我們方便的被動吸附金綴合優(yōu)化套件進行優(yōu)化,。
與被動吸附相比,，共價偶聯(lián)將感興趣的分子固定在功能化金納米顆粒上（例如帶有NHS、羧基或胺基團）,。與被動吸附方法相比,，這種方法大大提高了蛋白質涂層的穩(wěn)定性。共價偶聯(lián)使用與待綴合分子上的特定化學基團反應的化學接頭,。因此，該方法比被動吸附方法更具特異性和可控性,，并且可以針對特定應用優(yōu)化共價綴合配體的數量,。通過接頭的共價偶聯(lián)還具有最小化空間位阻和對綴合蛋白三級結構的影響的優(yōu)點?？偠灾?，這對綴合蛋白的性質產生的有害影響較小。
我們的羧基金納米粒子,、羧基金納米海膽和羧基金納米棒均依賴于 EDC/NHS 化學進行結合,。 EDC 和 NHS“激活"顆粒表面的羧基，形成中間體,，隨后與特定蛋白質或其他待綴合配體上的伯胺基團反應,。EDC 綴合的效率通常較低，并且對 pH 值和共價鍵敏感耦合協(xié)議需要一定程度的優(yōu)化才能實現所需的性能或穩(wěn)定性,。
以下方案提供了將生物分子與我們的羧化金納米顆粒偶聯(lián)的一般指南,，以標準 IgG 與我們的 20 nm 羧基金納米顆粒的偶聯(lián)為例。對于其他生物分子或納米粒子類型的綴合,，最佳綴合條件可能會有所不同,。為了獲得與顆粒表面的最大結合,，用于結合的蛋白質的量比全覆蓋所需的理論量多大約1至10倍。
20nm羧基金納米粒子
甲基金納米粒子（陰性對照）
1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)（Sigma,，目錄號 E1769）
N-羥基磺基琥珀酰亞胺 (Sulfo-NHS)（Sigma,，目錄號 56485）
陽性對照蛋白：辣根過氧化物酶 (HRP) 或來自人血清的 IgG（Sigma，目錄號 I4506）
阻斷劑：牛血清白蛋白 (BSA)（Sigma,，目錄號 A3059）
激活緩沖液：2-(N-嗎啉代)乙磺酸 (MES) 緩沖液（10 mM,，pH 5.5）
偶聯(lián)緩沖液：1X 磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)
洗滌緩沖液：1X 磷酸鹽緩沖鹽水 + 0.05% Tween 20 (PBST)
紫外可見分光光度計
待綴合的目標蛋白
注意：待綴合的蛋白質必須是純凈的且不含污染蛋白質（例如 BSA）和其他含胺成分。任何其他含有伯胺的分子都可能與待綴合的蛋白質競爭,，并可能導致綴合效率顯著降低,。該蛋白質還應該具有足夠的可接近的伯胺基團用于綴合。賴氨酸殘基是 EDC 綴合的主要靶位點,。
如果金納米粒子的濃度低于OD 50,，則通過離心濃縮它們。如果緩沖液中有顆粒,，則通過離心在純水中清洗它們,。有關說明，請參閱“金納米顆粒處理和儲存",。
在 MES 緩沖液中制備濃度分別為 30 和 36 mg/mL 的新鮮 EDC/NHS 混合溶液,。請注意，EDC/NHS 在水溶液中會迅速水解,，應在結合前新鮮制備,。
取 10 µL 20 nm 金納米粒子（水中 OD 50）并與步驟 2 中制備的 10 µL EDC/NHS 混合溶液混合。
室溫孵育 30 分鐘
添加 1 mL PBST 并渦旋
6,500 g 離心 30 分鐘
除去大部分上清液
添加 10 µL 抗體（1 X PBS 中 1 mg/mL）*
在水浴超聲儀中超聲 10 秒
室溫下攪拌孵育 2 至 4 小時
添加 1 mL PBST 并渦旋
6,500 g 離心 30 分鐘
除去大部分上清液
添加 50 µL PBS 和 1% BSA
儲存于 4 度即可使用
* 蛋白質的濃度可能會根據顆粒大小和要結合的蛋白質而變化,。一般來說,，蛋白質的量應比全表面覆蓋的量多 1 至 10 倍。應估計顆粒的總表面積和對接面積,，以計算最佳的蛋白質含量,。下表是將 IgG 與不同尺寸的羧基金顆粒結合的一般參考。其他蛋白質的計算類似,，但需要計算您感興趣的蛋白質的對接面積,。
表 I. EDC 綴合期間不同尺寸的羧基金納米顆粒的 IgG 的建議量。 IgG 分子的對接面積估計為 45 nm2,。 “NX全覆蓋量"是指孵育量與顆粒表面全覆蓋所需量之間的過量比,。
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