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免疫熒光是一種免疫染色技術(shù),，可使用熒光顯微鏡觀察樣品中的抗原。使用有機(jī)溶劑和化學(xué)交聯(lián)劑仔細(xì)固定樣品,，以保持其細(xì)胞完整性以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),。然后對(duì)它們進(jìn)行透化以進(jìn)行免疫染色，然后進(jìn)行封閉以盡量減少非特異性結(jié)合,。然后用抗體對(duì)樣品進(jìn)行免疫染色,，并通過(guò)熒光反應(yīng)使目標(biāo)顏色可視化。

材料

• 10X PBS：要制備 1L,，將 80g NaCl,、2g KCl、2g KH2PO4 和 28.5g NaHPO4 添加到 1L 注射用水中,。將 pH 值調(diào)整至 7.4,。

• 4% 聚甲醛：要制備 100mL，將 4g 聚甲醛添加到 100mL 1×PBS 中,。將 pH 值調(diào)整至 7.4,。

• 1×PBS/0.2% Triton X-100(PBS/Triton)：要制備 500mL，將 1mL Triton X-100 添加到 500mL 1× PBS 中,。

• 1×PBS/3% BSA(PBS/BSA)：配制100mL時(shí),，將3g BSA加入到100mL 1×PBS中。

協(xié)議

    準(zhǔn)備 固定 透化

1. 在 PBS 中短暫沖洗細(xì)胞,。

2. 吸出PBS,，用4%聚甲醛覆蓋細(xì)胞至2-3mm深度約200ul。

3. 讓細(xì)胞在室溫下固定 15 分鐘,。

4. 吸出固定液,，用 PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘,。

5. 吸出PBS,，用PBS/Triton在室溫下將細(xì)胞覆蓋至2-3mm深度約200ul 5分鐘。

6. 吸出滲透劑在 PBS 中沖洗 3 次,，每次 5 分鐘,。

免疫染色

1. 將 200ul 用 PBS/BSA 稀釋的一抗輕輕添加到 24 孔板的每孔中。

2. 37℃ 孵育 60 分鐘或 4℃ 過(guò)夜,。

3. 吸出稀釋的一抗,，然后在 PBS 中沖洗 3 次，每次 5 分鐘。

4. 將用 PBS/BSA 稀釋的熒光染料偶聯(lián)二抗加入到 24 孔板中,，每孔 100ul,，室溫避光孵育 30 分鐘。

5. 吸出稀釋的熒光染料偶聯(lián)二抗,，然后在 PBS 中沖洗 3 次,，每次 5 分鐘。

6. 在熒光顯微鏡下測(cè)試,。