隨著反相快速色譜法在反應(yīng)混合物純化中的使用增加,，出現(xiàn)了很多問題,，因為許多化學(xué)家不像正相或硅膠柱色譜法那樣熟悉這項技術(shù)?；瘜W(xué)家提出的問題之一是關(guān)于 pH 調(diào)節(jié)劑（特別是酸）的使用及其純化,。
在反相占主導(dǎo)地位的 HPLC 領(lǐng)域，通常使用酸（甲酸,、乙酸等）,，通常濃度為 0.1%。其基本原理是,，如果樣品成分在溶液中可電離,，則其色譜保留和峰形可能會受到影響，并且其定量也會受到挑戰(zhàn),。
電離/可電離化合物在溶液中時在帶電狀態(tài)和中性狀態(tài)之間保持平衡,。這些分子在中性溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行色譜分析時，可以顯示為前峰（想想滑雪坡）,，因為電離部分比中性狀態(tài)更易溶于水,，因此洗脫得更快。添加 pH 調(diào)節(jié)劑,，無論是酸還是堿,，都可以迫使平衡全進(jìn)入中性狀態(tài)或進(jìn)入電離狀態(tài)。當(dāng)全電離時,，化合物會提前洗脫,；當(dāng)中性時，該化合物更具疏水性,，并且其在柱上的保留增強(qiáng),。
例如，我們來看看通過琥珀酸酐和 α-甲基芐胺的微波反應(yīng)生成的合成 N-(1-苯乙基)琥珀酰亞胺的純化,，如圖 1 所示,。
圖 1. 使用 Biotage® Initiator+ 微波反應(yīng)器進(jìn)行琥珀酸酐與 α-甲基芐胺的反應(yīng)
當(dāng)使用中性溶劑純化時,，產(chǎn)品前沿很差，表明它處于電離態(tài)和中性態(tài)之間的平衡,，圖 2,。
圖 2. 使用中性水和乙腈的反應(yīng)混合物反相快速色譜顯示前沿產(chǎn)物峰。
產(chǎn)品作為非高斯前沿峰洗脫的問題是,，它是一個寬廣的峰,，并且收集在多個柱體積 (CV) 中。這意味著收集的產(chǎn)物被稀釋在比典型或期望更多的溶劑中,，這增加了蒸發(fā)餾分溶劑的體積和時間,，并增加了較低純度和回收率的可能性。事實上,，該反應(yīng)混合物中存在較早洗脫的副產(chǎn)物,，其污染了早期產(chǎn)物級分。是的,，這些餾分可以被丟棄,，但這會降低回收的產(chǎn)品產(chǎn)量，這不一定是理想的解決方案,。
通過將酸（在本例中為0.2%冰醋酸）引入到水和乙腈中,，可電離的反應(yīng)混合物組分質(zhì)子化。質(zhì)子化產(chǎn)物的洗脫帶減少（銳化）,，從而增加了其濃度以及與污染副產(chǎn)物的分離,，圖 3。副產(chǎn)物也質(zhì)子化,，導(dǎo)致其比中性流動相更早洗脫,。結(jié)果是大大改善了分離，產(chǎn)物以更集中的譜帶洗脫,，并且與副產(chǎn)物的分離度更高,。
圖 3. 使用酸化溶劑系統(tǒng)純化反應(yīng)混合物，使產(chǎn)物峰尖銳并降低干擾副產(chǎn)物的保留,。
然而,，化學(xué)家在使用 pH 值修改的流動相時需要小心，因為潛在的化合物保留隨 pH 值變化而變化,。在前面的例子中,，電離化合物移動是有幫助的，但質(zhì)子化化合物并不總是朝著有利的方向移動,。當(dāng) pH 值發(fā)生變化時,，洗脫的化合物可能會相互靠近甚至共洗脫。
我們可以看到這種情況發(fā)生在由靛紅酸酐和 α-甲基芐胺微波反應(yīng)生成的合成產(chǎn)物 2-氨基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺中，圖 4,。
圖 4. 靛紅酸酐與 α-甲基芐胺的微波反應(yīng)
當(dāng)使用中性水/甲醇梯度純化時，我們可以看到一些極性副產(chǎn)物在產(chǎn)品之前洗脫,，以及強(qiáng)烈保留的副產(chǎn)物在產(chǎn)品后面以 9.5 至 14 CV 之間的寬峰形式洗脫,，圖 6。
圖 6. 反應(yīng)混合物的 pH 中性反相快速色譜
在兩種洗脫溶劑中添加 0.2% 冰醋酸后,，洗脫化合物的保留率發(fā)生顯著變化,。副產(chǎn)物在中性 pH 值下以 4 CV 洗脫，在酸性條件下離子化并以 1.5 CV 洗脫,。尾隨的疏水性副產(chǎn)物也電離并移近產(chǎn)物,，圖 7。
圖 7. 使用酸化水/甲醇梯度純化反應(yīng)混合物,，改變了兩種副產(chǎn)物的保留,。
隨著產(chǎn)物和尾隨副產(chǎn)物之間分辨率的降低，該反應(yīng)純化的負(fù)載能力降低,，這意味著需要更大的柱（和更多的溶劑）來充分純化反應(yīng)產(chǎn)物,。
因此，雖然流動相 pH 值調(diào)整有助于改善純化,，但請注意,，洗脫體積和選擇性可能會發(fā)生變化，從而可能降低純化效率,。
用于創(chuàng)建此數(shù)據(jù)的設(shè)備包括：
Biotage®引發(fā)劑+微波反應(yīng)器
Biotage® Selekt Single 快速色譜系統(tǒng)
Biotage® Sphere C18 色譜柱,，12 克
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