ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）是蛋白質(zhì)檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)"方法,。1在本博客中，回顧了三種流行的 ELISA 平臺：標(biāo)準(zhǔn) ELISA,、免疫 PCR和單分子陣列 (SIMOA),。我們將對這些 ELISA 的設(shè)計原理、樣本量,、儀器和靈敏度進行比較,。
ELISA的基本設(shè)計原理取決于抗體-抗原相互作用的穩(wěn)定性和特異性。簡而言之,，固定在珠子或微孔板等固體基質(zhì)上的捕獲抗體可與多種樣品類型中的目標(biāo)蛋白結(jié)合,。此類樣品可包括血漿、血清,、細(xì)胞和組織裂解物,、條件培養(yǎng)基或尿液。
1971 年引入 ELISA 時,，酶標(biāo)記抗原被纖維素顆粒上的抗體捕獲,。2然后通過反復(fù)離心和洗滌分離抗體-抗原綴合物。此后,，不同的 ELISA 格式被開發(fā)出來,，包括夾心 ELISA，其中目標(biāo)蛋白“夾在"捕獲抗體和標(biāo)記檢測抗體之間（圖 1）,。這種 ELISA 格式具有高度特異性,，因為需要兩種抗體與蛋白質(zhì)結(jié)合才能進行檢測,。此外，可以用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定蛋白質(zhì)濃度（即定量數(shù)據(jù)）,。
這里討論的 ELISA 平臺——標(biāo)準(zhǔn) ELISA,、免疫 PCR和單分子陣列 (SIMOA) ——是生成定量數(shù)據(jù)的夾心 ELISA,。然而，它們在底物,、檢測方法,、儀器、樣品體積和靈敏度方面有所不同,。
標(biāo)準(zhǔn) ELISA (sELISA) 將捕獲抗體固定到透明塑料 96 孔微孔板上（圖 2,、表 1）。該檢測抗體與辣根過氧化物酶 (HRP) 結(jié)合,，該酶可將其底物 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 還原為藍(lán)色和氧化形式。顏色的變化與 HRP 的量成正比,，并且推論與樣品中目標(biāo)蛋白的量成正比,。添加硫酸可終止 HRP-TMB 反應(yīng)，導(dǎo)致顏色從藍(lán)色變?yōu)辄S色,。使用酶標(biāo)儀在 450 nm 處測量吸光度,。
| 標(biāo)準(zhǔn) | 免疫PCR | SIMOA™ | |
|---|---|---|---|
| 基質(zhì) | 96孔微孔板 | 96孔PCR板 | 珠子 |
| 檢測方法 | 比色法 | 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) | 熒光 |
| 樂器 | 讀板器 | 實時熒光定量PCR儀 | 專用儀器 |
| 樣品量* | 100微升 | 10-25 µL | 125微升 |
| 靈敏度 | 高的 | 更高 | 最高 |
表 1. 標(biāo)準(zhǔn) ELISA,、免疫 PCR 和單分子陣列 (SIMOA) 的比較,。 * = 樣品稀釋后每次重復(fù)的最終體積,。
sELISA 的靈敏度一般范圍為 1 pg/ml 至 100 pg/ml。然而,，一些 sELISA 的定量限 (LLOQ) 低至亞 pg/ml 或高達(dá) 10 ng/ml,。與所有 ELISA 一樣，靈敏度取決于所用抗體的靈敏度,。
對于標(biāo)準(zhǔn) 96 孔板,，最終樣品體積為每孔 100 µL。使用“半面積"板可以減少體積 (50 µL) ,，其中孔的直徑為一半寬,，但測定靈敏度也可能會降低。用于任何ELISA 的原始樣品體積將取決于最佳樣品稀釋度,，該稀釋度會因蛋白質(zhì),、樣品類型和實驗而異。
將樣品添加到板中后,，大約 5 小時內(nèi)即可獲得結(jié)果,。然而，當(dāng)樣品和抗體同時添加到板中時,，可以實現(xiàn)更快的周轉(zhuǎn)時間,。這減少了孵育步驟和洗滌步驟的數(shù)量。例如,，SpeedELISA的處理時間為 3 小時,，在添加樣品之前同時孵育板上的捕獲和檢測抗體。其他方法包括一步添加樣品和兩種抗體,，或者將樣品和檢測抗體一起添加,。然而，減少處理時間會降低靈敏度（圖 3）,。
sELISA 的主要優(yōu)點是提供低成本試劑盒,，可以針對來自多個物種的數(shù)千種不同蛋白質(zhì)。此外,，sELISA 幾乎不需要培訓(xùn),，可生成易于解釋的數(shù)據(jù)，并使用與其他檢測兼容的經(jīng)濟實惠的酶標(biāo)儀,。這些優(yōu)點導(dǎo)致 sELISA 在研究中得到廣泛使用,。
免疫 PCR也稱為免疫定量 ELISA (IQELISA)，將捕獲抗體粘附到塑料 96 孔 PCR 板上,，同時檢測抗體與 DNA 條形碼綴合（圖 4,、表 1）。使用 PCR,，雙鏈 (ds) DNA 條形碼在條形碼特異性引物和與 dsDNA 結(jié)合的熒光染料存在的情況下分別被擴增和染色,。熒光與 dsDNA 的量成正比，因此也與樣品中目標(biāo)蛋白的量成正比,。使用實時 PCR 儀器測量熒光,。
IQELISA 的一個優(yōu)點是其體積要求小,，每次重復(fù)的最終體積僅為 10 µL。因此,，當(dāng)樣品量有限或難以獲得樣品時,，IQELISA 是一個特別有吸引力的選擇。然而,，IQELISA 比 sELISA 在技術(shù)上更具挑戰(zhàn)性,，因為它需要更精確的移液,。此外，樣品應(yīng)至少重復(fù)三次,，因為小體積會增加異常值的機會,。
DNA 通過 PCR 擴增循環(huán)呈指數(shù)增長。因此,，與使用相同抗原和抗體對的 sELISA 相比,，IQELISA 的 LLOQ 平均增加了 23 倍。靈敏度的增加取決于抗體,，范圍從無變化到 105 倍（圖 5）,。
從樣品孵育到數(shù)據(jù)收集，IQELISA 大約需要 5.5 小時,。該周轉(zhuǎn)時間與 sELISA 類似,。
SIMOA是一種超靈敏 ELISA,，使用抗體包被的珠子和熒光偶聯(lián)的檢測抗體（圖 6,、表 1）。將珠子,、樣品和檢測抗體混合在一起后,，將溶液施加到具有超過 235,000 個微孔的卡盒中。每個微孔只能容納一顆珠子,。然后將油添加到卡盒中,，將樣品推過微孔陣列的表面并形成孔的液密密封。
使用配備熒光顯微鏡的全自動或半自動系統(tǒng)測量熒光,；該儀器由 SIMOA（ Quanterix ,；Billerica，MA,；美國）開發(fā)商制造,。由于每個孔只能包含一個珠子,，因此具有熒光的微孔的數(shù)量與樣品中目標(biāo)蛋白的量成正比。這使得單分子檢測成為可能,。
SIMOA 的一個關(guān)鍵優(yōu)勢是它可以檢測飛摩爾范圍內(nèi)的蛋白質(zhì),。也就是說，靈敏度通常在 10 fg/ml 至 1 pg/ml 范圍內(nèi),。與 sELISA 和 IQELISA 相比,，SIMOA 的平均靈敏度分別提高了 465 倍和 63 倍。
將試劑裝入 Quanterix 儀器后,，大約需要 3 小時才能獲取數(shù)據(jù),。因此，SIMOA 的程序時間比 sELISA 和 IQELISA 都短,。
雖然 SIMOA 實現(xiàn)了此處評測的三個平臺中的一些最高靈敏度,，但該技術(shù)也有一些缺點。首先,，目前使用該技術(shù)分析的蛋白質(zhì)數(shù)量很少（~165）,。其次，SIMOA 試劑盒的成本高于 sELISA 和 IQELISA 試劑盒,。第三,，檢測儀器價格昂貴，且只能用于SIMOA,，是專用儀器，需要專門培訓(xùn)才能運行,。
值得一提的是,，IQELISA 和 SIMOA 分別可以同時分析多達(dá) 3 個和 6 個目標(biāo),。除了需要更少的樣品之外，在分析相同數(shù)量的蛋白質(zhì)時,，多重檢測通常比單重檢測更具成本效益,。重要的是，多重檢測會降低 IQELISA 的靈敏度,，而使用SR-X TM生物標(biāo)志物檢測系統(tǒng)的SIMOA 則不會影響靈敏度,。
還提供其他定量多重 ELISA 選項，包括 Quantibody® 和 RayPlex TM 抗體陣列,。Quantibody可以使用 100 µL 稀釋樣品在 6 小時內(nèi)分析多達(dá) 40 種蛋白質(zhì),，一式四份。使用兼容的激光掃描儀采集數(shù)據(jù),。RayPlex可以使用流式細(xì)胞術(shù)在 4 小時內(nèi)每次重復(fù)使用 25 µL 稀釋樣品測量多達(dá) 25 種蛋白質(zhì),。兩種抗體陣列的靈敏度與 sELISA 相似。
在我們的博客“使用抗體陣列進行多重蛋白質(zhì)檢測"或我們的視頻“為您的研究識別正確的抗體陣列"中了解如何確定用于多重蛋白質(zhì)檢測的正確抗體陣列,。
標(biāo)準(zhǔn) ELISA,、免疫 PCR (IQELISA) 和 SIMOA 相互比較時具有優(yōu)點和缺點：
sELISA是一種簡單的比色測定法，數(shù)據(jù)易于解釋,，因此幾乎不需要培訓(xùn),。使用能夠測量 450 nm 吸光度的酶標(biāo)儀在 5 小時內(nèi)獲得數(shù)據(jù)。使用比 IQELISA 和 SIMOA 試劑盒便宜的試劑盒可以靶向數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)。然而,，與 IQELISA 和 SIMOA 相比,，sELISA 的靈敏度低。
免疫PCR使用實時PCR儀器,，在6小時內(nèi)收集數(shù)據(jù),。在此介紹的三個 ELISA 平臺中，它的體積要求低,，但比 sELISA 需要更多的移液和數(shù)據(jù)分析技術(shù)專業(yè)知識,。平均而言，其靈敏度比 sELISA 高 23 倍,?？梢酝瑫r檢測 3 種蛋白質(zhì)，但檢測靈敏度會降低,。
SIMOA的靈敏度最高,，其靈敏度平均分別比 sELISA 和 IQELISA 提高了 465 倍和 63 倍。使用需要專門培訓(xùn)的昂貴專用儀器可在 3 小時內(nèi)獲得數(shù)據(jù),。它還需要比 sELISA 和 IQELISA 更多的樣本量,。一次可以分析多達(dá) 6 種蛋白質(zhì)，而不會影響靈敏度,。
圖 8 表明,，對于許多蛋白質(zhì)，LLOQ 的總體改進遵循以下趨勢：SIMOA > IQELISA > sELISA,。不過,，也有例外。例如,，IQELISA 對人 IL-1β 的靈敏度最高,，為 0.0064 pg/ml，而 sELISA 和 SIMOA 的 LLOQ 分別為 0.3 和 0.04 pg/ml,。
最常見的蛋白質(zhì)檢測工具之一是 ELISA,。在這里，我們比較了三種流行的夾心 ELISA 平臺：標(biāo)準(zhǔn) ELISA,、免疫 PCR和單分子陣列 (SIMOA),。在為研究選擇合適的 ELISA 時，其底物,、檢測方法,、儀器、樣品量,、靈敏度和成本是重要的考慮因素,。標(biāo)準(zhǔn) ELISA 是流行的方法，因為 可以使用低成本 試劑盒來靶向來自多個物種的數(shù)千種不同蛋白質(zhì),。此外,，它幾乎不需要培訓(xùn)即可運行，其數(shù)據(jù)易于解釋,，并且使用非專用 酶標(biāo)儀 與其他測定兼容,。一個關(guān)鍵要點是 ELISA 靈敏度和成本之間需要權(quán)衡：靈敏度越高，成本越高,。成本考慮了套件,、培訓(xùn)、勞動力和所需儀器的價格,。因此,，sELISA 是實惠的選擇，而 SIMOA 是最敏感的,。
對于不具備必要的專業(yè)知識或設(shè)備來使用此處討論的 ELISA 平臺分析樣品的實驗室,，RayBiotech Life, Inc. 提供完整的測試服務(wù)。該服務(wù)提供完整的報告，包括原始數(shù)據(jù),、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量數(shù)據(jù),。蛋白質(zhì)濃度。
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