Nanogold®-鏈霉親和素原位雜交

1.4 nm Nanogold® 金納米粒子探針 體積小，不聚集,，因此能夠接觸核抗原,，這使得它們成為超靈敏原位雜交檢測特定 DNA 序列（無論是否使用原位PCR）的優(yōu)秀試劑。

內(nèi)容

• Nanogold®-鏈霉親和素原位雜交

• Nanogold®-Silver原位雜交與“CARD"系統(tǒng)

• 使用 Nanogold®-Silver原位雜交與“CARD"系統(tǒng)進(jìn)行 RNA 檢測

• 使用 Nanogold®-鏈霉親和素-銀進(jìn)行免疫標(biāo)記來檢測針對單克隆一抗的生物素化二抗

優(yōu)點(diǎn)

• 結(jié)合標(biāo)簽擴(kuò)增單基因拷貝分辨率,，比 NBT-BCIP 堿性磷酸酶或過氧化物酶更靈敏,。

• 大多數(shù)情況下不需要更冗長的 PCR 程序。

• 避免由于錯(cuò)誤引發(fā)和擴(kuò)增子擴(kuò)散而導(dǎo)致 PCR 出現(xiàn)假陽性,。

• 使用標(biāo)準(zhǔn)明場顯微鏡可輕松看到黑色,；不需要昂貴的熒光光學(xué)器件，也沒有自發(fā)熒光和漂白信號丟失的問題,。

• 黑色與全強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞和核染色劑（H＆E,、核固紅、甲基綠）兼容,，極大地改善了形態(tài)學(xué)評估,。

• 也可用于 EM 研究。

單獨(dú)給出了 Nanogold®-鏈霉親和素原位雜交的完整方案,，無論是否有 CARD 系統(tǒng),。

Nanogold®-鏈霉親 和素原位雜交

© 伊頓出版公司；經(jīng)許可使用,。

圖 1：納米金-銀原位雜交技術(shù)的示意圖,。通過與生物素標(biāo)記的 cDNA 探針雜交來檢測宿主細(xì)胞中的 DNA 序列。然后使用鏈霉親和素-Nanogold 檢測與間隔臂共價(jià)結(jié)合的生物素,，并隨后使用乙酸銀或乳酸銀自動(dòng)金相術(shù)進(jìn)行銀增強(qiáng),。為簡單起見，僅顯示了四種此類生物素和鏈霉親和素-Nanogold 分子,。 Hacker, GW,、Hauser-Kronberger, C.、Zehbe, I.,、Su, H.,、Schiechl, A.、Dietze, O. 和 Tubbs, R.,；細(xì)胞視覺,， 4,，54-65（1997）。

 

 

使用該方法檢測人乳頭瘤病毒6/11型基因組如下所示,；可以看出,，Nanogold®-銀染色產(chǎn)生濃密的黑色信號，在許多情況下比使用傳統(tǒng)酶底物獲得的信號更清晰,。

納米金銀 ISH 檢測尖銳濕疣中的 HPV 6/11,。在這種情況下，獲得了強(qiáng)標(biāo)記,。大多數(shù)感染的細(xì)胞核呈致密黑色或顆粒狀黑色染色,。一些細(xì)胞核還顯示出單個(gè)黑點(diǎn)標(biāo)記，表明這種 DNA 病毒的拷貝數(shù)非常低,。染色如方案中所述,；福爾馬林固定、7 微米厚的石蠟切片,，用蘇木精和伊紅復(fù)染,。放大倍數(shù)，X 285,。

Nanogold®-Silver原位雜交與“CARD"系統(tǒng)

CARD - 催化報(bào)告沉積（也稱為TSA® 或酪酰胺信號放大,；可從NEN Life Sciences獲得的試劑盒） - 是一種系統(tǒng)，其中鏈霉親和素連接的過氧化物酶分子用于在感興趣的位點(diǎn)催化積累生物素化的酪酰胺,。這在使用 Nanogold®-鏈霉親和素和銀增強(qiáng)進(jìn)行檢測之前,，在程序中插入了額外的擴(kuò)增步驟；結(jié)果是靈敏度大幅提高,，從而可以檢測單拷貝基因,，而不會(huì)遇到 PCR 相關(guān)的困難。

圖2：CARD-納米金-銀 原位雜交技術(shù)的示意圖,。通過與 FITC 標(biāo)記的核糖核酸探針雜交來檢測宿主細(xì)胞中的 RNA 序列,。然后針對 FITC 的第一抗體層與用作核酸報(bào)道分子的 FITC 分子結(jié)合。下一層是針對提供一抗的物種 IgG 的二抗,，用生物素標(biāo)記,。為了簡單起見，僅顯示了這兩種抗體中的每一種,。然后生物素與鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶（S-ABC-過氧化物酶）復(fù)合物結(jié)合,。顯示了四個(gè)這樣的分子，每個(gè)分子都攜帶過氧化物酶,。然后,，這些過氧化物酶分子催化生物素化酪酰胺的積累（催化報(bào)告沉積），最終導(dǎo)致生物素標(biāo)記的“倍增",。作為最后一層,，鏈霉親和素-Nanogold隨后使用醋酸銀或乳酸銀放大（自動(dòng)金相學(xué)）,。這些最終的鏈霉親和素分子中的每一個(gè)都可以檢測許多生物素分子中的一個(gè)。通過這種方式,，可以實(shí)現(xiàn)巨大的擴(kuò)增,，在許多情況下無需 PCR 或 3SR 技術(shù)即可實(shí)現(xiàn)單基因拷貝敏感性。

Hacker, GW,、Hauser-Kronberger, C.、Zehbe, I.,、Su, H.,、Schiechl, A.、Dietze, O. 和 Tubbs, R.,；細(xì)胞視覺,， 4，54-65（1997）,。

© 伊頓出版公司,；經(jīng)許可使用。

該程序用于檢測宮頸癌標(biāo)本培養(yǎng)的 SiHa 細(xì)胞中的 HPV-16（一種 cDNA 病毒）,。已知這些細(xì)胞僅含有一到幾個(gè)病毒 DNA 拷貝,； Nanogold®-鏈霉親和素原位雜交與 CARD 結(jié)合產(chǎn)生細(xì)胞核的致密黑色顆粒染色；黑色信號比過氧化物酶-鏈霉親和素產(chǎn)生的信號更容易區(qū)分,。該程序可能會(huì)在 5 至 7 小時(shí)內(nèi)完成,；

通過 CARD 擴(kuò)增的納米金銀ISH 檢測到 SiHa 細(xì)胞中 HPV 16 的單拷貝。這種源自宮頸癌的細(xì)胞系僅含有一到幾個(gè) HPV 16 拷貝,，通過所應(yīng)用的技術(shù)顯示為單個(gè)斑點(diǎn)（詳細(xì)信息請參閱實(shí)驗(yàn)方案）,。細(xì)胞離心涂片制備，用核固紅復(fù)染,。在福爾馬林固定石蠟材料的組織切片中獲得了類似的染色(Zehbe等人,，Am.J.Pathol.150 , 1553-1561(1997))。原始放大倍數(shù),，X 560,。

使用 Nanogold®-Silver原位雜交與“CARD"系統(tǒng)進(jìn)行 RNA 檢測

RNA的檢測具有同樣高的靈敏度，如下圖：

霍奇金病中的 Epstein-Barr 病毒,；使用RNA 檢測方案進(jìn)行高靈敏度檢測的示例,。原始放大倍數(shù)，X 400,。

使用 Nanogold®-鏈霉親和素-銀進(jìn)行免疫標(biāo)記來檢測針對單克隆一抗的生物素化二抗

Nanogold®-鏈霉親和素在免疫標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中也能發(fā)揮良好作用,。下面顯示了一個(gè)例子，其中它用作針對針對單克隆一抗的生物素化多克隆二抗的三級探針,，以探測乳腺癌抗原,。

使用間接 Nanogold® 標(biāo)記檢測 Ki-67 乳腺癌抗原,。使用一抗和生物素化山羊抗小鼠二抗檢測 Ki-67 抗原；使用 Nanogold®-鏈霉抗生物素蛋白（250 倍稀釋）和自動(dòng)金相學(xué)對其進(jìn)行可視化,。原始放大倍數(shù),，X 400。