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用    途：用于小鼠血清,、血漿及相關(guān)液體樣本中腫瘤壞死因子α（TNF-α）測(cè)定,。

工作原理

本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定樣品中小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。向預(yù)先包被了小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）,，溫育,；溫育后，加入生物素標(biāo)記的抗TNF-α抗體,。再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合,，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育和洗滌,，去除未結(jié)合的酶,，然后加入底物A、B,，產(chǎn)生藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）的濃度呈正相關(guān),。

試劑盒組成

需要而未提供的試劑和器材

1． 37℃恒溫箱,。

2． 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。

3． 精密移液器及一次性吸頭

4． 蒸餾水,，

5． 一次性試管

6． 吸水紙

注意事項(xiàng)

1． 從2-8℃取出的試劑盒,，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標(biāo)包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。

2． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,，以避免試驗(yàn)誤差

3． 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

4． 為避免交叉污染,，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜,。

5． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用,。保質(zhì)前使用,。

6． 底物B對(duì)光敏感,，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次,。

自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中

標(biāo)本要求

1．不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

2．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

操作程序

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：(本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。)

2. 根據(jù)代測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔,。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔,。

3. 加樣：1）空白孔,，空白對(duì)照孔不加樣品，生物素標(biāo)記的抗TNF-α抗體,，鏈霉親和素-HRP,，只加顯色劑A&B和終止液，其余各步操作相同,；2）標(biāo)準(zhǔn)品孔：加入標(biāo)準(zhǔn)品50ul,，鏈霉親和素-HRP50ul(標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體，故不加),；3）代測(cè)樣品孔：加入樣本40ul,，然后各加入抗TNF-α抗體10ul、鏈霉親和素-HRP50ul,，蓋上封板膜,，輕輕震蕩混勻，37℃溫育60分鐘,。

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用,。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次,，拍干,。

6. 顯色：每孔先加入顯色劑A50ul，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.

7. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。

8. 測(cè)定：以空白空調(diào)零,，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。

9. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計(jì)算,。

操作程序總結(jié)：

1.準(zhǔn)備試劑,，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

2.加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，生物素標(biāo)記的二抗和酶標(biāo)試劑,，37℃反應(yīng)60分鐘

3.洗板5次,，加入顯色液A、B,，37℃顯色15分鐘

4.加入終止液

5.10分鐘內(nèi)讀OD值

6.計(jì)算

檢測(cè)范圍：20ng/L→480 ng/L,。

保存：2-8℃。

有效期：6個(gè)月(2-8℃),。