臨床試驗(yàn)引起了科學(xué)界的關(guān)注，并激發(fā)了人們對(duì) CAR 研究和開發(fā)的興趣,。因此,，CAR 設(shè)計(jì)自誕生以來(lái)已經(jīng)發(fā)生了巨大的發(fā)展，但其總體結(jié)構(gòu)經(jīng)受住了多次試驗(yàn),，并繼續(xù)為 T 細(xì)胞療法的開發(fā)提供有效的框架,。

抗原結(jié)合域

與傳統(tǒng)抗體類似，抗原結(jié)合域賦予 CAR 靶點(diǎn)特異性,。因此,，該結(jié)構(gòu)域還決定了 CAR-T 細(xì)胞療法的親和力和親和力，從而影響其療效,。傳統(tǒng)上,，CAR 的這一組件源自單克隆抗體的可變重鏈 (V H ) 和輕鏈 (VL )，通過(guò)接頭結(jié)合形成單鏈可變片段 (scFv),。

這些 scFv 通常靶向癌細(xì)胞的膜結(jié)合表面受體,，并導(dǎo)致主要組織相容性復(fù)合物 (MHC) 獨(dú)立的 T 細(xì)胞激活。由于其在細(xì)胞激活中的作用,，抗原親和力必須足夠高和選擇性,，但不足以誘導(dǎo)表達(dá) CAR 的 T 細(xì)胞死亡。此外，研究還表明,，對(duì)同一靶標(biāo)具有相似親和力的 CAR-T 細(xì)胞可能會(huì)導(dǎo)致截然不同的臨床結(jié)果,。這些差異可以通過(guò)癌細(xì)胞表面的表位位置和抗原密度等因素來(lái)解釋。

抗原結(jié)合域開發(fā)的另一個(gè)重要考慮因素是scFv 聚集,。 scFv 在強(qiáng)直信號(hào)傳導(dǎo)（即以不依賴于抗原的方式進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)）中發(fā)揮重要作用,，因此，它們的過(guò)度聚集可導(dǎo)致高強(qiáng)直信號(hào)傳導(dǎo)和隨后的 T 細(xì)胞早期耗盡,。聚集可能是由低折疊穩(wěn)定性或 V H -V L界面處暴露的疏水殘基引起的,。限制這種效應(yīng)使我開始對(duì) T 細(xì)胞中 CAR 的表達(dá)水平進(jìn)行精細(xì)控制。

簡(jiǎn)而言之,，CAR-T細(xì)胞的最佳治療效率始于在親和力,、表位特異性和CAR表達(dá)水平方面實(shí)現(xiàn)平衡。這反過(guò)來(lái)又凸顯了在開發(fā)早期階段需要進(jìn)行廣泛的 scFv 表征和工程設(shè)計(jì),。

鉸鏈區(qū)

鉸鏈區(qū)或間隔區(qū)是 CAR 的胞外結(jié)構(gòu),，從抗原結(jié)合域延伸至跨膜域。該區(qū)域?yàn)?scFv 提供了靈活性,，可用于增強(qiáng)對(duì)空間上無(wú)法接近的區(qū)域中目標(biāo)表位的識(shí)別,。

鉸鏈設(shè)計(jì)，即長(zhǎng)度和組成,，也會(huì)影響 CAR 表達(dá),、信號(hào)傳導(dǎo)和強(qiáng)度激活輸出。最佳間隔長(zhǎng)度取決于靶表位的位置和靶細(xì)胞上的空間位阻水平,。例如,，大量研究表明，長(zhǎng)間隔區(qū)可以更好地接近近膜表位或糖基化抗原,。相反,，當(dāng)靶向膜遠(yuǎn)端表位時(shí)，短鉸鏈更有用,。但實(shí)際上,，間隔區(qū)長(zhǎng)度需要針對(duì)每個(gè)特定的配體-scFv 對(duì)進(jìn)行定制。與 scFv 對(duì)特定抗原的親和力類似,，長(zhǎng)間隔區(qū)可以產(chǎn)生特別強(qiáng)烈的體內(nèi)反應(yīng),，但也會(huì)導(dǎo)致激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

常用的鉸鏈區(qū)源自膜結(jié)合受體（CD8 或 CD28）或 IgG（IgG1 或 IgG4）,。然而,，已知 IgG 衍生的間隔區(qū)與 Fcγ 受體 (FcγR) 相互作用，導(dǎo)致先天免疫反應(yīng)激活和 CAR-T 細(xì)胞耗竭,。因此,，大多數(shù) IgG 衍生的間隔區(qū)都會(huì)發(fā)生突變,，以盡量減少與 FcγR 的相互作用,。

除了在 CAR 信號(hào)傳導(dǎo)中的作用外,，鉸鏈區(qū)還常用于在工程化后量化和純化 T 細(xì)胞的 CAR 陽(yáng)性子集。為此,，當(dāng)與 IgG 衍生的間隔區(qū)一起使用時(shí),，可以使用抗 Fc 抗體。此外,，Strep標(biāo)簽序列已成功引入CAR間隔區(qū),，以確保更有效地定量和純化CAR陽(yáng)性細(xì)胞。

跨膜結(jié)構(gòu)域

跨膜結(jié)構(gòu)域將胞外 CAR 結(jié)構(gòu)域錨定到 T 細(xì)胞膜上,。與 CAR-T 細(xì)胞結(jié)構(gòu)的其他模塊相比,，評(píng)估跨膜結(jié)構(gòu)域的重要性和作用的文獻(xiàn)要少得多。然而,，最近的報(bào)告表明,，該結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和組成可以改變表面表達(dá)水平并決定所表達(dá)的 CAR 的膜穩(wěn)定性。跨膜結(jié)構(gòu)域已被證明可以控制涉及CAR 組裝,、激活和聚類的其他關(guān)鍵反應(yīng),。此外，已知該結(jié)構(gòu)域會(huì)影響細(xì)胞因子的釋放,，如果過(guò)量,，可能會(huì)導(dǎo)致高度的非特異性毒性。

作為一般規(guī)則,，大多數(shù) CAR 包含源自相鄰鉸鏈或信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的同一蛋白質(zhì)的跨膜序列,。這些結(jié)構(gòu)域大部分源自CD3z、CD4,、CD8α 或 CD28,，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都賦予 CAR-T 細(xì)胞截然不同的特性。例如,，CD3δ衍生的跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)е?CAR 摻入內(nèi)源性 TCR（T 細(xì)胞受體）中,，這通常伴隨著 T 細(xì)胞激活的增加和復(fù)合物穩(wěn)定性的降低。相比之下,，CD8α 或 CD28 衍生的跨膜結(jié)構(gòu)域顯示出增強(qiáng)的膜穩(wěn)定性,。有必要更多地研究這些結(jié)構(gòu)域?qū)?CAR-T 穩(wěn)定性和療效的影響。

細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域

胞質(zhì)內(nèi)或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是受體的功能末端,。雖然胞外域（抗原結(jié)合域和間隔域）負(fù)責(zé)引導(dǎo) T 細(xì)胞朝向特定靶點(diǎn),，而跨膜域?qū)?CAR 錨定在膜上，但胞內(nèi)域的作用是將信號(hào)傳遞至 T 細(xì)胞并啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián),。

然而,，為了有效響應(yīng),，共刺激信號(hào)對(duì)于維持級(jí)聯(lián)至關(guān)重要。在絕大多數(shù) FDA 批準(zhǔn)的 CAR-T 細(xì)胞中,，主要信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域通常源自 CD3z,，而共刺激結(jié)構(gòu)域（與 CD3z 相鄰）源自 CD28 和 4-1BB (CD137)。其他共刺激信號(hào),，例如 ICOS,、CD27、MYD88 加 CD40 和 OX40 也在臨床前試驗(yàn)中證明了功效,，但需要更多的研究來(lái)確定它們的體內(nèi)功效,。

共刺激結(jié)構(gòu)域還決定T 細(xì)胞分化途徑、代謝周期,、細(xì)胞凋亡和激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,。近年來(lái)，功能性細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域的研究在科學(xué)界中越來(lái)越重要,，因此,，優(yōu)化其設(shè)計(jì)策略是確保功效的重要方法。