1.簡介
三（2-羧乙基）膦（TCEP）和N-（2-氨基乙基）馬來酰亞胺三fu乙酸鹽購自 西格瑪-奧爾德里奇.聚合物水凝膠作為瞬時人工細胞外基質(zhì)（ECM）替代品廣泛用于組織工程技術(shù)中，以提供機械支持,、細胞粘附位點,、細胞響應重塑以及營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的運輸[3-5]?；谔前肪厶牵℅AG）的聚合物網(wǎng)絡已成為一種特別強大的水凝膠變體,，因為它們允許細胞因子的仿生給藥以指導細胞命運決定[6]。為了利用由此產(chǎn)生的選擇,，我們之前開發(fā)了一種基于GAG的水凝膠的理論驅(qū)動設計概念,，能夠獨立調(diào)節(jié)多個細胞指導性基質(zhì)線索[7]： 由多臂（星形）聚乙二醇（星形PEG）和GAG肝素形成的生物雜化水凝膠通過摻入基質(zhì)金屬蛋白酶敏感（MMP）肽進行交聯(lián)，以實現(xiàn)細胞響應性重塑和整合素結(jié)合RGD肽以控制細胞粘附[8-12],。改變星形PEG與肝素的摩爾比和反應混合物的固體含量,，為在水凝膠生物活性成分的固定濃度下調(diào)節(jié)交聯(lián)度和機械材料性能創(chuàng)造了選擇[7,，12-14]。帶高度負電荷的GAG肝素與大量不同化學因子和生長因子的非共價絡合物相吻合,，包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGFa）,，成纖維細胞生長因子2（FGF2）， 基質(zhì)細胞衍生因子（SDF1α）[10,，15–23],。合理設計的星形PEG-GAG水凝膠可以使用不同的交聯(lián)反應形成：GAG的羧酸基團和胺封端的星型PEG肽單元之間的同肽鍵可以通過活性酯（碳化二亞胺）化學形成[13]?；蛘?，馬來酰亞胺官能化的GAG可以用硫醇封端的星型PEG偶聯(lián)物使用邁克爾型加成反應方案轉(zhuǎn)化[12]。后一種方法允許細胞和組織兼容的原位凝膠,，因此適用于微創(chuàng)植入技術(shù),。 GAG的羧酸基團與胺封端的星型PEG肽單元之間的同肽鍵可以通過活性酯（碳化二亞胺）化學形成[13]?；蛘?，馬來酰亞胺官能化的GAG可以用硫醇封端的星型PEG偶聯(lián)物使用邁克爾型加成反應方案轉(zhuǎn)化[12]。后一種方法允許細胞和組織兼容的原位凝膠,，因此適用于微創(chuàng)植入技術(shù)。 GAG的羧酸基團與胺封端的星型PEG肽單元之間的同肽鍵可以通過活性酯（碳化二亞胺）化學形成[13],?；蛘撸R來酰亞胺官能化的GAG可以用硫醇封端的星型PEG偶聯(lián)物使用邁克爾型加成反應方案轉(zhuǎn)化[12],。后一種方法允許細胞和組織兼容的原位凝膠,，因此適用于微創(chuàng)植入技術(shù)。
雖然以前的體內(nèi)研究一直在探索星形PEG-GAG水凝膠的生物醫(yī)學應用,，包括祖細胞在缺血組織中的積累[10],，慢性皮膚傷口的抗炎治療和愈合[24，25]以及帕金森病的新細胞移植策略[20],，但他們主要關(guān)注材料的細胞指導特性,，沒有研究宿主對植入物的反應。植入后,，所有生物材料都會不同程度地誘導異物反應,，并消除它們與宿主組織的相互作用[26]。 據(jù)報道,，降解和細胞浸潤速率（作為組織重建的第一階段）以及材料的動態(tài)變化物理性質(zhì)及其呈現(xiàn)可溶性介質(zhì)分子（特別是生長因子）的能力決定了植入物的命運[28],。皮下注射時，不含GAG成分的純PEG水凝膠可誘發(fā)顯著炎癥反應,，摻入RGD細胞粘附配體可部分減弱炎癥反應[29,，30],。此外，PEG水凝膠已加載各種類型的生長因子,，以促進所需的促再生過程,，例如血管形成（VEG Fa）[31]或骨修復（骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2））[27]。然而 到目前為止,，還沒有研究評估原位組裝星形PEG-GAG水凝膠的異物反應,，由于摻入的GAG單元作為高親和力結(jié)合位點，可持續(xù)地提供生長因子,，并允許獨立調(diào)整物理網(wǎng)絡特性,，粘附性和細胞響應重塑。作為細胞外基質(zhì)的組成部分,，GAG在活組織中實現(xiàn)許多不同的功能,。它們創(chuàng)建信號介質(zhì)庫并調(diào)節(jié)其功能，在胚胎發(fā)生和發(fā)育[32,，33],，體內(nèi)平衡[34]，炎癥[35],，腫瘤形成和進展[36]中發(fā)揮多方面作用,。提到基于GAG的細胞指導材料的重要性， 本研究旨在系統(tǒng)地評估宿主對具有不同物理和粘附特性,、生物降解特性和促血管生成生長因子功能化的模塊化原位形成starPEG-GAG水凝膠的反應模式,。選擇野生型免疫功能正常小鼠（C57BL/6J）皮下植入作為代表性模型[37-40]。對皮下植入材料的免疫和血管生成反應通過組織學確定,，包括H&E,，CD31和CD68染色。通過評估材料的細胞浸潤和鄰近組織的血管化來評估靶組織中水凝膠的整合,。報告數(shù)據(jù)證明了優(yōu)異的組織相容性,， 建議使用可調(diào)原位組裝星形PEG-GAG水凝膠，用于安全有效的體內(nèi)組織工程應用,。
2.材料和方法
2.1.半胱氨酸封端PEG-（MMP）的合成與純化4
如前所述,，合成了PEG-肽偶聯(lián)物（PEG-（MMP）4）[12]。簡而言之,，在肽合成器（Activo P14,，Activotec）上采用標準Fmoc固相法合成了MMP可切割的Ac-GGPQGIWGQG-GCG-NH2（MMP）肽，并通過分析HPLC色譜法（1100系列;安捷倫科技）和 MALDI 質(zhì)譜（布魯克達爾托尼克有限公司）,。接下來,，將500mg四臂馬來酰亞胺封端的PEG-（馬來酰亞胺）4（MW 10000）溶解在5ml水中，并與溶解在5ml水中的350mgMMP肽（過量5%）混合。接著,，加入5ml磷酸鹽緩沖液pH 7.4,。通過加入1M NaOH將反應混合物的pH調(diào)節(jié)至pH 7.5–8。反應在N2氣氛下運行5 h,，反應完成后進行HPLC,。 為了去除StBu保護基團，將摩爾過量（肽）TCEP溶液（pH 7-8）加入反應混合物中,，并在室溫下攪拌數(shù)小時,。接下來，將反應混合物蒸發(fā),，溶于水中,，并通過制備型HPLC純化。從HPLC收集產(chǎn)物,，與0.1ml 1M HCl混合并冷凍干燥至少24小時,。將所得的白色粉末形式的PEG-肽偶聯(lián)物（PEG-（MMP）4）儲存在-20°C。1毫升1M HCl并冷凍干燥至少24小時,。將所得的白色粉末形式的PEG-肽偶聯(lián)物（PEG-（MMP）4）儲存在-20°C,。1毫升1M HCl并冷凍干燥至少24小時。將所得的白色粉末形式的PEG-肽偶聯(lián)物（PEG-（MMP）4）儲存在-20°C,。
2.2.肝素-馬來酰亞胺偶聯(lián)物的合成純化
所有肝素馬來酰亞胺偶聯(lián)物均如前所述合成[12,，41]。簡而言之,，將三倍摩爾過量的EDC和1.5倍摩爾過量的sNHS（指馬來酰亞胺）加入溶解在3ml超純水中的0.5g肝素溶液中,。將反應混合物在4°C下保持20分鐘。接著,，將溶解在超純水中（4°C）中的N-（2-氨基乙基）馬來酰亞胺三fu乙酸鹽加入到反應混合物中并在室溫下攪拌過夜,。通過透析（分子量截止值為8kDa的膜）對1 l的1 M氯化鈉純化3次偶聯(lián)物,，然后用1 l水透析5次,，以除去任何未反應的馬來酰亞胺。然后將產(chǎn)物冷凍干燥至少24小時并儲存在-20°C,。 形成的偶聯(lián)物的純度和反應性由HPSEC（1100系列;安捷倫科技公司）,。
用于肽合成的所有溶劑和試劑均購自IRIS Biotech GmbH.Tris（2-羧乙基）膦（TCEP）和N-（2-氨基乙基）馬來酰亞胺三fu乙酸鹽購自Sigma-Aldrich。四臂馬來酰亞胺封端聚乙二醇（Mn=10.0×103;PDI = 1.06）購自JenKem Technology USA Inc.所有試劑均按原樣使用,，未經(jīng)初步純化,。
2.3.水凝膠制備
如前所述制備水凝膠[9]。凝膠制備與體內(nèi)植入在同一天進行,。簡而言之,，將10mg肝素 - 馬來酰亞胺偶聯(lián)物（MW 15000）溶解在107μl磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）（生物色素）中。將肝素溶液在冰上冷卻，并以3mM的終濃度加入0.79mg cRGD（國際肽）中,。肝素-RGD溶液與小鼠重組生長因子（VEG Fa,，F(xiàn)GF2或SDF1α;培普羅科技）。每個植入物的最終生長因子量是變化的,，如表1所示,。10mg的PEG-MMP偶聯(lián)物（MW 15920）或PEG（MW 15000），溶解在372μlPBS中,。肝素-RGD溶液與PEG或PEG-MMP偶聯(lián)液以1∶1的比例輕輕混合,， 并將30μl溶液迅速夾在兩個涂有Sigmacote（Sigma-Aldrich）的5mm玻璃蓋玻片之間。凝膠在室溫下在一分鐘內(nèi)形成,。交聯(lián)后,，除去蓋玻片，留下圓盤狀水凝膠,。將每個凝膠盤立即浸入400μlPBS中以防止脫水,，并儲存在4°C直至植入。
2.4.流變學
通過在裝有25 mm平行板幾何形狀的旋轉(zhuǎn)流變儀（Ares LN2,，TA儀器）上進行的膨脹凝膠盤上的振蕩測量來確定水凝膠的存儲模量,。頻率掃描在25 °C下進行，剪切頻率范圍為100-102 rad/s,，應變幅度為2%,。儲能模量和損耗模量均作為剪切頻率的函數(shù)進行測量。由于水凝膠的彈性,，損耗模量比儲能模量低幾個數(shù)量級,，并且低于流變儀的測量極限。存儲模量的平均值是通過至少三個獨立實驗計算的,，每個實驗包括三個技術(shù)重復,。為了評估膠原酶降解對儲能模量的影響， 在4°C下形成水凝膠,，加入1U / mlIV型膠原酶（生物色素）,，以1Hz掃描，直到?jīng)]有進一步增加的剛度,。然后將溫度升高至37°C以激活膠原酶,，并繼續(xù)1Hz掃描直至植入物降解。
2.5.動物和外科手術(shù)
所有動物護理和實驗程序均由薩克森州區(qū)域辦事處（Landesdirektion Sachsen）動物護理和使用委員會以及德累斯頓工業(yè)大學機構(gòu)動物護理和使用委員會（24-9168.11-6/2012-1）批準,。將C57BL / 6 J OlaHsd菌株（Harlan Laboratories GmbH）的12周齡雄性小鼠飼養(yǎng)在單通風籠中（每籠3-4只小鼠）,。
在手術(shù)前，通過腹膜內(nèi)注射lv胺酮100mg / kg和甲苯噻嗪10mg / kg對小鼠進行稱重和麻醉,。將動物的背部剃光并用乙醇消毒,。通過將水凝膠盤插入皮下的小口袋中并用縫合線閉合皮膚來皮下植入。植入硅盤（硅橡膠MDX4-4210生物醫(yī)用級彈性體，道康寧）作為對照,。每只小鼠在背部的右側(cè)和左側(cè)獲得兩個植入物,。兩種植入物中的一種含有生長因子。實驗裝置包括每個條件八只小鼠,，盡管并非所有水凝膠支架都可以在實驗結(jié)束時取回,。監(jiān)測所有小鼠，直到它們從麻醉中恢復,。在 7 天或 28 天時,， 小鼠通過CO2窒息和頸椎脫位死亡。將植入物和全層真皮組織的相鄰區(qū)域一起切除,，并立即固定在10%緩沖的福爾馬林（Fisher Scientific）中以進行后續(xù)分析,。
2.6.組織學
對固定的組織樣品進行自動化組織處理，包括在乙醇和二甲苯溶液中逐漸脫水,。之后,，將樣品嵌入石蠟塊（Paraplast Plus）中，并使用旋轉(zhuǎn)切片機切割矢狀切片,，包括相鄰的修復組織,，并使用親和素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC）技術(shù)和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物試劑用CD31和CD68抗體染色。此外,，所有切片均用蘇木精-伊紅（H&E）染色（細胞核-藍色;細胞質(zhì),，彈性蛋白和膠原粉紅色）染色。使用自動玻片掃描儀Axio Scan.Z1和Plan-Aurochromat 20×/0.8 M27（蔡司）觀察和拍攝染色切片,。
2.7.圖像分析
使用ImageJ分析圖像,。根據(jù)表2，從盲圖像1到5對水凝膠的降解進行評分,。通過反復測量與植入物相鄰處形成的囊的寬度來評估異物反應,。對血管生成的影響被量化為重塑水凝膠內(nèi)肉瘤下方組織或直接相鄰組織中可見的CD31陽性血管。
2.8.統(tǒng)計分析
在所有體外實驗中,，測試了來自每個水凝膠的至少三個樣品,。數(shù)據(jù)以平均值±標準差（SD）表示。通過單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計分析,。數(shù)據(jù)以平均值±標準差（SD）表示,。統(tǒng)計分析通過單因素方差分析（ANOVA）進行,，如果沒有其他描述,。任何小于 0.05 的 P 值都具有統(tǒng)計學意義。
上海牧榮生物科技有限公司
國內(nèi)試劑耗材經(jīng)銷代理,。
國外試劑的訂購,。可提供歐美實驗室品牌的采購方案。
提供加急物流處理,，進口貨物,，最快交期1-2周。
進出口貨物代理服務,。
公司代理眾多有名生命科學領(lǐng)域的研究試劑,、儀器和實驗室消耗品品牌：CELL DATA,Alamanda Polymers， cstti,，Click Chemistry tools,，Nanoprobes，Ancell,，NANOCS,，Ambeed, Inc，SPEED BioSystems, LLC,，Tulip Biolabs, Inc,，Torrey Pines Biolabs，magsphere ,FabGennix International ,paratechs,，Medicago,Oraflow,CWE,Wasatch Photonics, alphananote, It4ip, proteoform, Caprico等,重點合作品牌 Lee Biosolutions,chematech,Nanopartz,denovix,Atto tec,macrocyclics等,。
質(zhì)量保證，所有產(chǎn)品都提供售后服務,。付款方式靈活,。公司堅持“一站式"服務模式，為客戶全面解決實驗,、生產(chǎn),、開發(fā)需求。公司整合國際與國內(nèi)資源,，加強網(wǎng)絡建設,，提高公司內(nèi)部運作效率，為客戶提供方便,、快捷的服務,。
公司突出創(chuàng)新思維，提高工作效能,，減低運作成本,，為客戶提供優(yōu)惠的價格。
5
立即詢價
您提交后,，專屬客服將第一時間為您服務