介紹
在過去的幾十年中,，納米技術已經(jīng)很好地發(fā)展到構建藥物遞送系統(tǒng)，包括但不限于膠束,、脂質體和納米顆粒[1-10],。與傳統(tǒng)制劑相比，這些納米級給藥系統(tǒng)（DDS）在提高藥物穩(wěn)定性,、防止藥物過早釋放、改變藥物分布和延長藥物半衰期方面表現(xiàn)出巨大潛力[11],。因此,，它們被廣泛用于各種藥物的輸送，包括抗癌藥物[1,，2],，抗菌劑[3，4]和抗炎藥[5,，6]等,。
納米級DDS雖然在單藥治療藥物方面表現(xiàn)出優(yōu)勢，但在提高多病因疾病綜合療效方面仍存在諸多局限性,。事實上,，許多常見的臨床疾病是由多種因素相互作用引起的或惡化的。例如,，燒傷創(chuàng)面感染常因細菌感染而加重,，例如銅綠假單胞菌（銅綠假單胞菌）和金黃色葡萄球菌（金黃色葡萄球菌）[12]。當肝實質和代謝功能的大量喪失誘發(fā)急性肝衰竭時,，患者將變得易感病原體,，這在很大程度上限制了晚期緊急肝移植的可行性[13]。另據(jù)報道,，細菌感染可能是誘導腫瘤形成的主要原因之一,， 因此，應同時采用抗癌和抗菌措施治療這些疾病,，例如幽門螺桿菌誘發(fā)的胃癌[14],。因此，為了治療多因素疾病,，應合理開發(fā)DDS,，以共同遞送治療劑和抗菌劑，如抗生素[3]、抗菌肽[15,，16],、金屬離子[4]和天然化合物[17]。
為此,，最常見的策略之一是在一個制劑中共同遞送兩種或兩種以上的藥物[18,，19]。然而,，由于納米載體的載藥空間有限,，共遞送策略通常無法同時實現(xiàn)多種藥物的充分載樣[18-20]。最近,，聚（異賴氨酸）（PLL）基聚合物已被制造用于封裝帶負電荷的藥物,，例如小分子藥物[21-23]，蛋白質[24,，25]和核酸[26,，27]。值得注意的是,，Qiao等人[15]發(fā)現(xiàn)基于PLL的聚合物具有類似于普通抗菌肽（AMP）的殺菌機制,，具有去除細菌感染的巨大潛力。我們之前的研究[16]還表明,，多臂PLL（MPLL）具有高抗菌活性,、巨大的選擇性和顯著的蛋白水解穩(wěn)定性， 代表了一系列治療耐藥感染的強效抗菌肽[16],。所有這些研究進展都預測,，基于PLL的聚合物不僅可以作為藥物載體，還可以作為具有治療活性的大分子來協(xié)同治療效果,，這意味著納米醫(yī)學針對多因素疾病的設計有了新的視角,。
在這項研究中，設計,、合成和評估了MPLL-alt-PEG（方案1）形式的聚乙二醇（PEG）交聯(lián)交替共聚物,，作為陰離子藥物遞送和抗菌的平臺。具有支化聚乙烯亞胺（PEI）核心和聚（i-賴氨酸）外圍鏈的MPLL構成了MPLL-alt-PEG共聚物的聚電解質段,。它們的多臂分子結構具有較高的陽離子電荷密度,，有利于通過靜電相互作用增強對陰離子藥物和細菌脂質雙層的結合親和力[16]。預計MPLL-alt-PEG可以包封陰離子藥物,，然后自組裝成殼交聯(lián)聚離子復合物（PIC）膠束（方案1）,。 我們之前的研究表明，殼交聯(lián)膠束可能具有優(yōu)勢,，無效載藥,，提高膠束穩(wěn)定性,，并保護藥物免于過早釋放和降解[28]。同時,，交聯(lián)后MPLL的抗菌活性也可以提高,，因為交聯(lián)反應會導致分子量、蛋白水解穩(wěn)定性和體內半衰期增加[16,，29],。載藥MPLL-alt-PEG膠束可以整合負載藥物的治療效果和載體的抗菌活性。我們證明了MPLL-alt-PEG作為小分子藥物和治療性生物大分子的DDS的可行性,，使用水溶性甲基橙（MO）和免疫激素重組人干擾素-a-2b（IFN）作為陰離子模型藥物,。隨后 以革蘭陽性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和革蘭陰性銅綠假單胞菌為模型菌，研究了MPLL-alt-PEG的抗菌活性和機制,。我們預計基于MPLL-alt-PEG的納米平臺可以作為治療細菌感染涉及多因素疾病的潛在系統(tǒng),。
2.材料與方法
2.1.材料
支化PEI（Mw = 0.8 kDa）是從Sigma-Aldrich（中國上海）獲得的。g-芐氧羰基-L-賴氨酸（ZLL）購自GL Biochem（中國上海）,，無需進一步純化即可使用,。PEG（琥珀酰亞胺羧甲酯）2（SCM-PEG-SCM，Mw = 7.5 kDa）由JenKem科技有限公司（中國北京）提供,。甲基橙、苯甲醚,、甲磺酸,、和異硫氰酸熒光素（FITC）均來自阿拉丁（中國上海）,。Viskase（美國伊利諾伊州達連）生產(chǎn)了分子量截止值（MWCO）為7和14 kDa的透析管,，而50 kDa和100 kDa的透析管則從Spectrum Laboratories Inc.（美國加利福尼亞州洛杉磯）購買。IFN（500萬U）是從安徽安科生物科技有限公司（中國安徽）獲得的,。
2.2.MPLL-alt-PEG共聚物的合成與表征
在PEI引發(fā)的e-芐氧羰基-L-賴氨酸N-羧酸酐（ZLL-NCA）聚合的連續(xù)過程中合成MPLL-alt-PEG共聚物,，以制備PEI接枝聚（e-芐氧羰基-L-賴氨酸）（PEZ），然后與雙官能團SCM-PEG-SCM進行外圍交聯(lián),，隨后去除芐氧羰基側鏈保護基團（圖1）,。
第一步，根據(jù)我們之前的報告,，ZLL在無水乙酸乙酯中光氣化（收率：78%）制備ZLL-NCA,，然后以PEI為大分子引發(fā)劑聚合d，得到星嵌段共聚物PEZ（產(chǎn)率：92%）[16,，24,，28，30],。
然后,，將100mgPEZ溶解在50mLDMSO和250mL二氯甲烷（DCM）的混合物中,。將DCM中濃度為0.2g-mL-1的SCM-PEG-SCM溶液滴加到PEZ溶液中，在25°C劇烈攪拌條件下滴加24小時,，產(chǎn)生PEZ-alt-PEG[28],。通過旋轉蒸發(fā)濃縮溶液以除去DCM，并透析（MWCO 14 kDa）對水,。隨后,，通過凍干得到PEZ-alt-PEG共聚物。產(chǎn)率：95%,。
最后,，將PEZ-alt-PEG溶于TFA中，然后加入苯甲醚和甲磺酸,，室溫攪拌1.5h后,，用蒸餾水稀釋溶液，洗滌3次,。收集水層,，然后用碳酸氫鈉中和。之后,，將樣品轉移到透析管（MWCO 7 kDa）中,，并在5.0wt%NaHCOg水溶液下透析兩天，隨后在蒸餾水中透析五天,。然后將透析產(chǎn)物凍干以獲得最終產(chǎn)物MPLL-alf-PEG,。產(chǎn)量： 91 %
以DMSO-M為溶劑，在布魯克DMX 400 MHz波譜儀（德國卡爾斯魯厄布魯克）上端接P EZ和PEZ-alt-PEG的核磁共振（NMR）波譜,，而MPLL-alt-PEG以D2 O為溶劑,。各種cop聚合物的分子量通過配備沃特世51 5 HPLC泵和沃特世2414折光率檢測器的凝膠滲透色譜（GPC）系統(tǒng)（美國米爾福德沃特斯）測定。為了表征PEZ和PEZ-alt-PEG,，使用線性聚甲基丙烯酸甲酯（PMMAs）作為標準品,，以二甲基甲酰胺（DMF）為洗脫液分析樣品。為了表征MPLL-alt-PEG,，對樣品進行測量,，并使用0.50 M H Ac-N和Ac緩沖液（pH 4.5）作為淋洗液，線性PEG作為st標準品,。
2.3.載藥MPLL-alt-PEG膠束的制備與表征
為了評估MPLL-alt-PEG對小陰離子分子的封裝,，將給定量的MO加入到水中的MPLL-alt-PEG溶液中（10mL）中并攪拌5分鐘。然后將獲得的溶液在下沉條件下對水透析（MWCO 50 kDa）以除去游離客體分子,。在相同條件下,，選擇具有等量游離MO的溶液作為透析對照。當對照組MO溶液透析至無色時,，得到MO/MPLL-alt-PEG膠束,，用紫外-可見分光光度計測定透析液中MO的含量,。采用標準校準曲線定量0.1-6 mg-L-1濃度范圍內線性相關系數(shù)（r2）>0.99的MO，載藥量以MO對聚合物的質量百分比計算,。
為了評估MPLL-alt-PEG對陰離子生物大分子的包封,，按照報道的方法用FITC標記IFN[31]。隨后,，將MPLL-alt-PEG和FITC標記的IFN（FITC-IFN）溶液分別溶解在濃度為2mg-mL-1的0.01M磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中,。然后將1 mL IFN溶液滴加到5 mL聚合物溶液中，在超聲儀上超聲處理5 min（KQ-200 KDE,，昆山超聲儀器有限公司
中國昆山,，40 kHz，100 W）,，然后在下沉條件下用0.01 M磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）透析（MWCO 100 kDa）,。游離FITC-IFN在0.01M磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中也作為對照進行透析。當對照實驗中的游離IFN去除后,，使用FITC-IFN的標準校準曲線,，使用FITC-IFN的標準校準曲線，通過Spectramax Gemini XS微孔板熒光計（分子器件合作,，美國加利福尼亞州桑尼維爾）測量外透析液中FITC-IFN的量,，然后從添加的FITC-IFN總量中減去該值以計算FITC-IFN的負載量。載藥量計算為FITC-IFN對聚合物的質量百分比,。
使用JEOL JEM-1400透射電子顯微鏡在100 kV的工作電壓下觀察成型膠束的形貌（JEOL,，日本東京）。使用Zetasizer Nano ZS90（英國伍斯特郡馬爾文儀器有限公司）在25°C下記錄聚合物和膠束的粒徑和zeta電位,。測試前使用0.01 M磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）將溶液稀釋至1 mg-mL-1。
2.4.pH 敏感釋放從膠束
將裝有FITC-IFN的膠束溶液（5 mL）轉移到透析袋（MWCO 100 kDa）中,，然后將袋子放入150 mL的0.02 M磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）,、0.02 M HAc-NaAc緩沖液（pH 5.5）或0.02 M HAc-NaAc緩沖液（pH 4.5）中。聚合物/FITC-IFN配合溶液的制備如第2.3節(jié)所述,。以預定的時間間隔,，抽出給定體積的釋放培養(yǎng)基并補充等體積的新鮮緩沖溶液。用微孔板熒光計測定IFN的釋放量,，計算藥物的累積釋放量,，并繪制藥物釋放的百分比與時間的關系圖。所有實驗一式兩份進行,。
2.5.最小抑菌濃度（MIC）的測量
采用肉湯微量稀釋法研究了聚合物對革蘭氏陽性MRSA和革蘭氏陰性銅綠假單胞菌的抗菌活性,。將細菌細胞在37°C的Mueller Hinton肉湯（MHB）培養(yǎng)基中以300rpm不斷振蕩以達到中期對數(shù)生長階段。將微生物懸浮液稀釋并調節(jié)至2 X 105菌落形成單位（CFU）-mL-1,。使用MHB對聚合物進行一系列兩倍稀釋,，細菌濃度范圍為60至0.2^M,。將每種稀釋的聚合物溶液共50個加入到96孔微孔板中，然后加入50 rL細菌懸浮液,，得到1 X 105 CFU-mL-1的最終接種物,。在37°C孵育18小時后，用酶標儀（Synergy HT,， BioTek Instruments Inc.,，Winooski，VT,，美國）,。未添加聚合物處理的細菌細胞和未添加細菌的聚合物溶液分別用作陽性和陰性對照。MIC被定義為18小時后抑制細菌生長的濃度,。
2.6.溶血測定
新鮮小鼠血液用K2EDTA處理,，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌3次，然后以1000g離心10分鐘以分離紅細胞,。然后,，獲得紅細胞并用PBS（pH 7.4）稀釋至終濃度為5%（v / v）。將50 rL不同濃度的聚合物溶液與等體積的紅細胞懸浮液在96孔微孔板上混合,，然后孵育1hat37°C,。 以1000X g 離心10分鐘后，將上清液的等分試樣（30RL）轉移到另一個96孔微孔板中,，并用100RL的PBS稀釋,。
通過使用Biotek Synergy TH酶標儀在540nm處測量吸光度來監(jiān)測紅細胞懸浮液中血紅蛋白的釋放。用2%Triton X-100裂解的紅細胞的吸光度用作陽性對照,，并采取100%溶血,，而PBS溶液中未經(jīng)處理的紅細胞懸浮液用作陰性對照。同時,，應用聚合物溶液對照樣品排除聚合物吸收干擾（假陽性結果）,，并根據(jù)報告的方法檢查是否存在假陰性結果[32]。每次測試重復三次,。根據(jù)以下公式（1）計算溶血百分比：
溶血 （%）=[（久樣品 — A 陰性）/0 陽性 — 久陰性）] X 100% （1） 其中 A 樣品代表處理樣品的吸光度,，^陰性代表陰性對照的吸光度，A陽性代表陽性對照的吸光度,。
本研究中的所有動物實驗均根據(jù)《實驗動物護理和使用指南》進行,，并得到汕頭大學醫(yī)學院動物倫理委員會（SUMC2016-200，2016年12月5日）的批準,。
2.7.微生物的成像研究
使用類似于MIC測定的方案在2X MIC下生長并與聚合物混合細菌細胞,。在37°C孵育90分鐘后，收集細菌細胞,，用PBS（5000X g,，10分鐘）洗滌兩次,，并在4°C下用等體積的2.5%戊二醛溶液固定4小時。 將細菌細胞在0.1M PBS（5000X g,，10分鐘）中沖洗,，并進一步固定在1%鋨酸（4°C中2小時）。在0.1M PBS中沖洗后,，通過分級系列乙醇（30-100%）使細胞脫水,。
為了通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM）觀察，將脫水樣品轉移到乙醇和乙酸異戊酯的1：1混合物中30分鐘,，然后轉移到絕對乙酸異戊酯中1 h,。對樣品進行臨界點干燥，濺射涂覆一層薄薄的金,，并用FE-SEM（SU8010;日立,，東京，日本）,。
為了通過透射電子顯微鏡（TEM）觀察,，將脫水樣品轉移到丙酮中20 min，轉移到丙酮和Spurr樹脂的1：1混合物中1 h,，然后轉移到樹脂和無水丙酮的3：1混合物中3 h,。最后，將樣品轉移到Spurr樹脂中并孵育過夜,。獲得厚度為70-90nm的切片,，并在TEM設置下進行TEM觀察之前用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色10分鐘（H-7650，日立,，東京,，日本）。
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.聚乙二醇交聯(lián)多臂聚（L-賴氨酸）具有包封能力和抗菌活性,，可用于感染相關多因素疾病的潛在治療
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