本方案提供了使用SAINT sRNA(目錄號(hào):SR-2003-01,、SR-2003-02,、SR-2003-04),。
無血清轉(zhuǎn)染方案:
1.準(zhǔn)備細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
粘附細(xì)胞:轉(zhuǎn)染前一天,,將細(xì)胞置于0.5ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基血清中,,使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)融合50-80%。
懸浮細(xì)胞:在制備復(fù)合物之前,,將0.5-1.5x106個(gè)細(xì)胞懸浮在0.5ml無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。
2.讓SAINT sRNA小瓶達(dá)到室溫,。
3.將SAINT sRNA充分渦旋約30秒,。
4.使用1:40的siRNA(µg)與SAINT sRNA(µl)比率制備復(fù)合物。
5.對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品,,按如下步驟制備復(fù)合物:
a.在50µl PBS中稀釋0.125μg siRNA,。
b.將5µl SAINT sRNA加入siRNA/PBS溶液中,輕輕重新懸浮,。
7.在室溫下將混合物孵育5-10分鐘(溶液可能看起來渾濁),。
8.向細(xì)胞中添加復(fù)合物:
粘附細(xì)胞:從細(xì)胞中吸取生長(zhǎng)培養(yǎng)基,并將復(fù)合物填充至0.5ml使用無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基,。向細(xì)胞中加入去復(fù)合物(0.5ml),。
懸浮池:將制備的復(fù)合物逐滴加入孔中。
9.在37°C的CO2孵化器中孵育細(xì)胞2-3小時(shí),。
10.在基因敲除測(cè)試前1-3天,。 向孔中加入1ml含血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基,并在37°C的CO2孵化器中孵育細(xì)胞,,
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