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Preeflow計(jì)量閥ECO-PEN700日益見(jiàn)長(zhǎng)

Preeflow計(jì)量閥ECO-PEN700日益見(jiàn)長(zhǎng)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：斷奶后（2~6個(gè)月）的關(guān)中奶山羊,，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)提供,。主要試劑：胎牛血清、分離液,、胰蛋白酶,、EDTA、地塞米松,、β-甘油磷酸鈉等試劑盒以及抗體均購(gòu)于武漢博士德公司,，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析提純。

1．2實(shí)驗(yàn)方法

1．2.1動(dòng)物模型選取選用斷奶后的關(guān)中奶山羊12只,，雌雄不限,，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成2組。1．2.2原代BMSCs的提取與培養(yǎng)選取斷奶的關(guān)中奶山羊,，骨髓的抽取和MSCs的分離,、培養(yǎng)按照馬勇江的方法進(jìn)行。

1．2.3細(xì)胞鑒定取培養(yǎng)第2代細(xì)胞,，先用0.25%的胰蛋白酶消化,，然后用PBS（磷酸鹽緩沖液）調(diào)整細(xì)胞濃度1×107個(gè)/ml，細(xì)胞鑒定采用CD34-FITC,、CD90-PE,、CD14-perCP,、CD54-APC對(duì)細(xì)胞標(biāo)記，置4℃避光孵育30min以上,，采用PBS洗1次,，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表面抗原檢測(cè)。

1．2.4細(xì)胞誘導(dǎo)取第2代細(xì)胞移入HG-DMEM液進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo),。

1．2.5礦化誘導(dǎo)鑒定采用堿性磷酸酶染色鑒定,。

1．2.6腺病毒介導(dǎo)的VEGF轉(zhuǎn)染選擇生長(zhǎng)良好的傳代細(xì)胞，待其生長(zhǎng)70%匯合時(shí),，用AdVEGF165轉(zhuǎn)染（感染倍數(shù)為50∶1）,，設(shè)置對(duì)照組（只加DMEM）。2組終末體積用含10%新生牛血清DMEM調(diào)5ml,，24h后,，換液加入含10%新生牛血清DMEM10ml中，于37℃,、5%的CO2條件下培養(yǎng),。分別于第1、3,、5,、7、9,、11,、13和15d收獲上清,離心后-70℃保存。上清標(biāo)本統(tǒng)一用VEGFELISA試劑盒檢測(cè)VEGF濃度,。

1．2.7復(fù)合物培育將環(huán)氧乙烷消毒備用的大小為30mm×5mm×5mm的珊瑚羥基磷灰石仿生人工骨分別放置于6個(gè)培養(yǎng)皿中,，每皿分別加入濃度為2×106個(gè)/ml的已轉(zhuǎn)染成功的MSCs，然后放入5％的CO2,、37℃孵箱中培養(yǎng),，每天觀察細(xì)胞在材料上及周邊的生長(zhǎng)情況，并照相記錄,。隔天換液,，培養(yǎng)3d，備用,。

1．2.8手術(shù)方法全身麻醉取俯臥位,，備皮，采用2%碘伏消毒術(shù)區(qū),，沿雙側(cè)腰背筋膜縱向切開(kāi),，分離長(zhǎng)肌和多裂肌，顯露雙側(cè)L5,、6棘突,，去除部分皮質(zhì)骨后*止血,，然后按照分組的不同于雙側(cè)橫突間各自植入基因增強(qiáng)人工骨骨條和自體骨條，肌肉覆蓋固定,，后逐層縫合切口并包扎,。于術(shù)前、術(shù)中,、術(shù)后各用青霉素20×104U肌注，植入后1～3d每日20×104U青霉素肌注,，植入后分欄飼養(yǎng),，不限活動(dòng)。

1．2.9手法觸診檢查植入物硬度,，輕柔檢測(cè)L5,、6活動(dòng)度，無(wú)活動(dòng)判定為融合,，有活動(dòng)判定為不融合,。

1．2.10影像學(xué)檢測(cè)術(shù)后4、8,、12周每只山羊拍攝前后位X線片,，觀察植骨處骨小梁長(zhǎng)入情況。有連續(xù)骨小梁長(zhǎng)入的判定為融合,，其他情況為不融合,。

1．2.11組織學(xué)檢測(cè)12周后將動(dòng)物處死，取出植入物,，福爾馬林固定24h,，環(huán)鋸水平修整后脫水，甲基丙烯酸輕乙基酯（GMA）和甲基丙烯酸丁酯（BMA）混合液浸透后包埋,、切片,，厚度為5μm。切片行HE染色,，觀察,。

1．2.12生物力學(xué)檢測(cè)處死動(dòng)物后取受力方向的骨塊，大小為4mm×4mm×3mm,，用材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)試,，加載速度為2mm/min。采用點(diǎn)壓技術(shù)和直徑2mm的圓柱形壓頭,，計(jì)算壓穿軟骨下骨板時(shí)的壓縮強(qiáng)度（從開(kāi)始加載的基點(diǎn)斷裂點(diǎn)峰值之間的壓力與壓頭面積的比值）,，在應(yīng)力應(yīng)變曲線上計(jì)量其彈性模量。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示,，組間差異采用方差分析,，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1細(xì)胞鑒定結(jié)果

剛接種的細(xì)胞為球形懸浮在胞液之中,，混有少量的血細(xì)胞,，4~5d后換細(xì)胞液，可見(jiàn)大量單核細(xì)胞呈圓形,，未*貼壁,；8~10d后換細(xì)胞液，可見(jiàn)單核細(xì)胞*貼壁,，變成梭形及多角形,，12d后大量單核細(xì)胞連接成片，形成纖維樣細(xì)胞集落,，15~20d后細(xì)胞逐漸匯集,，多呈長(zhǎng)梭形及多角形，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD90和CD54為陽(yáng)性,，CD34和CD14為陰性,，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原特征。

2．2成骨細(xì)胞誘導(dǎo)鑒定

12～14d基質(zhì)礦鹽形成鈣化結(jié)節(jié),，堿性磷酸酶染色可見(jiàn)胞漿被染成棕黑色,，并有黑色顆粒沉積，說(shuō)明培養(yǎng)形成的細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的特性,，具有體外成骨的能力（此種細(xì)胞含量超過(guò)80%）,。

2．3VEGF轉(zhuǎn)染結(jié)果

結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF分泌顯著高于未轉(zhuǎn)染組（P<0.01），分泌高峰在7～9d,，此后逐漸下降,，15d仍然可檢測(cè)到，且依然高于對(duì)照組,。

2．4手法觸診

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均存活且未見(jiàn)異常反應(yīng),，4周后均有活動(dòng)度，8周后CHA-MSCs-VEGF組無(wú)活動(dòng)度,，12周后2組均無(wú)活動(dòng)度,。

2．5影像學(xué)檢測(cè)

4周后均未見(jiàn)骨小梁，8周后開(kāi)始2組均可見(jiàn)骨小梁,。

2．6組織學(xué)檢測(cè)

CHA-MSCs-VEGF組術(shù)后12周有少量軟骨及大量的連續(xù)骨小梁形成,，可見(jiàn)皮質(zhì)骨圍繞，可見(jiàn)軟骨結(jié)構(gòu)形成,，之后成骨,，成骨代謝活性已非常接近正常，植入材料與骨組織達(dá)到骨性融合,，自體髂骨組術(shù)后12周可見(jiàn)新生骨組織形成,，但其成骨能力不及CHA-MSCs-VEGF組,。

2．7生物力學(xué)檢測(cè)

CHA-MSCs-VEGF組與自體組在大壓縮強(qiáng)度和彈性模量2方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3討論

MSCs是近幾年來(lái)研究熱門的干細(xì)胞,，具有在一定的培養(yǎng)條件下,，可以分化為骨細(xì)胞，維持一定時(shí)期內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)穩(wěn)定,、增殖速度較快,、細(xì)胞的生存適應(yīng)能力較強(qiáng)、貼壁時(shí)間短,、成活率高等優(yōu)點(diǎn),，是目前骨組織工程中較為理想的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用Percoll梯度離心法,，成功分離MSCs，并誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化,。支架物質(zhì)CHA是以特定的天然優(yōu)質(zhì)珊瑚為原料,，經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的熱液置換反應(yīng)，將珊瑚中的礦物質(zhì)轉(zhuǎn)換為羥基磷灰石并保留了珊瑚天然的孔隙,，得到物理結(jié)構(gòu)和無(wú)機(jī)成分與人體骨相似的產(chǎn)物,，其不僅具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和骨誘導(dǎo)物質(zhì)融合面積，而且其植入機(jī)體組織后有良好的生物相容性,，不產(chǎn)生局部或全身性毒性反應(yīng),，無(wú)炎癥排斥反應(yīng)，具有良好的成骨潛能,。為了促進(jìn)上述人工骨能更好地與機(jī)體組織融合,，本研究還加入了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），其為機(jī)體內(nèi)促進(jìn)血管生長(zhǎng)的重要的生長(zhǎng)因子,，在體內(nèi)外均可以特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)血管生成,。*，臨床骨折的愈合快慢與病損處血供有著密切的關(guān)系,，將VEFG基因轉(zhuǎn)染入人工骨的構(gòu)建之中,，可促進(jìn)骨組織血管的形成、加速骨質(zhì)間的融合和生長(zhǎng),。本實(shí)驗(yàn)中,，由觸診和影像學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該基因增強(qiáng)人工骨在融合速度上快于自體髂骨,，從組織切片上可看出,，其成骨的質(zhì)量上比自體髂骨更加成熟，在生物力學(xué)的檢測(cè)中,，該人工骨在大壓縮強(qiáng)度和彈性模量上均接近正常骨組織,。綜上所述,，CHA-MSCs-VEGF三聯(lián)人工骨復(fù)合物具有取材方便、培養(yǎng)簡(jiǎn)單,、相容性好,、成骨迅速、生物力學(xué)強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn),，有望廣泛應(yīng)用于臨床植骨融合手術(shù)中骨骼的替代材料,。