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Preeflow計量閥ECO-PEN700日益見長

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實驗動物：斷奶后（2~6個月）的關中奶山羊，均由西北農(nóng)林科技大學提供,。主要試劑：胎牛血清,、分離液、胰蛋白酶,、EDTA,、地塞米松、β-甘油磷酸鈉等試劑盒以及抗體均購于武漢博士德公司,，其他試劑為國產(chǎn)分析提純,。

1．2實驗方法

1．2.1動物模型選取選用斷奶后的關中奶山羊12只，雌雄不限,，采用隨機區(qū)組設計的方法將實驗動物分成2組,。1．2.2原代BMSCs的提取與培養(yǎng)選取斷奶的關中奶山羊，骨髓的抽取和MSCs的分離,、培養(yǎng)按照馬勇江的方法進行,。

1．2.3細胞鑒定取培養(yǎng)第2代細胞，先用0.25%的胰蛋白酶消化,，然后用PBS（磷酸鹽緩沖液）調(diào)整細胞濃度1×107個/ml,，細胞鑒定采用CD34-FITC、CD90-PE,、CD14-perCP,、CD54-APC對細胞標記，置4℃避光孵育30min以上,，采用PBS洗1次,，應用流式細胞儀進行表面抗原檢測。

1．2.4細胞誘導取第2代細胞移入HG-DMEM液進行培養(yǎng)誘導,。

1．2.5礦化誘導鑒定采用堿性磷酸酶染色鑒定,。

1．2.6腺病毒介導的VEGF轉(zhuǎn)染選擇生長良好的傳代細胞，待其生長70%匯合時,，用AdVEGF165轉(zhuǎn)染（感染倍數(shù)為50∶1）,，設置對照組（只加DMEM）。2組終末體積用含10%新生牛血清DMEM調(diào)5ml,，24h后,，換液加入含10%新生牛血清DMEM10ml中，于37℃,、5%的CO2條件下培養(yǎng),。分別于第1、3,、5,、7、9,、11,、13和15d收獲上清,離心后-70℃保存,。上清標本統(tǒng)一用VEGFELISA試劑盒檢測VEGF濃度,。

1．2.7復合物培育將環(huán)氧乙烷消毒備用的大小為30mm×5mm×5mm的珊瑚羥基磷灰石仿生人工骨分別放置于6個培養(yǎng)皿中，每皿分別加入濃度為2×106個/ml的已轉(zhuǎn)染成功的MSCs,，然后放入5％的CO2,、37℃孵箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞在材料上及周邊的生長情況,，并照相記錄,。隔天換液，培養(yǎng)3d,，備用,。

1．2.8手術方法全身麻醉取俯臥位,，備皮，采用2%碘伏消毒術區(qū),，沿雙側(cè)腰背筋膜縱向切開,，分離長肌和多裂肌，顯露雙側(cè)L5,、6棘突,，去除部分皮質(zhì)骨后*止血，然后按照分組的不同于雙側(cè)橫突間各自植入基因增強人工骨骨條和自體骨條,，肌肉覆蓋固定,，后逐層縫合切口并包扎。于術前,、術中,、術后各用青霉素20×104U肌注，植入后1～3d每日20×104U青霉素肌注,，植入后分欄飼養(yǎng),，不限活動。

1．2.9手法觸診檢查植入物硬度,，輕柔檢測L5,、6活動度，無活動判定為融合,，有活動判定為不融合,。

1．2.10影像學檢測術后4、8,、12周每只山羊拍攝前后位X線片,，觀察植骨處骨小梁長入情況。有連續(xù)骨小梁長入的判定為融合,，其他情況為不融合,。

1．2.11組織學檢測12周后將動物處死，取出植入物,，福爾馬林固定24h,，環(huán)鋸水平修整后脫水，甲基丙烯酸輕乙基酯（GMA）和甲基丙烯酸丁酯（BMA）混合液浸透后包埋,、切片,，厚度為5μm。切片行HE染色,，觀察,。

1．2.12生物力學檢測處死動物后取受力方向的骨塊，大小為4mm×4mm×3mm,，用材料試驗機測試,，加載速度為2mm/min,。采用點壓技術和直徑2mm的圓柱形壓頭，計算壓穿軟骨下骨板時的壓縮強度（從開始加載的基點斷裂點峰值之間的壓力與壓頭面積的比值）,，在應力應變曲線上計量其彈性模量,。

1．3統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，定量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示,，組間差異采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義,。

2結(jié)果

2．1細胞鑒定結(jié)果

剛接種的細胞為球形懸浮在胞液之中,，混有少量的血細胞，4~5d后換細胞液,，可見大量單核細胞呈圓形,，未*貼壁；8~10d后換細胞液,，可見單核細胞*貼壁,，變成梭形及多角形，12d后大量單核細胞連接成片,，形成纖維樣細胞集落,，15~20d后細胞逐漸匯集，多呈長梭形及多角形,，流式細胞儀檢測CD90和CD54為陽性,，CD34和CD14為陰性，符合骨髓間充質(zhì)干細胞表面抗原特征,。

2．2成骨細胞誘導鑒定

12～14d基質(zhì)礦鹽形成鈣化結(jié)節(jié),，堿性磷酸酶染色可見胞漿被染成棕黑色，并有黑色顆粒沉積,，說明培養(yǎng)形成的細胞具有成骨細胞的特性,，具有體外成骨的能力（此種細胞含量超過80%）。

2．3VEGF轉(zhuǎn)染結(jié)果

結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)上清液中VEGF分泌顯著高于未轉(zhuǎn)染組（P<0.01）,，分泌高峰在7～9d,，此后逐漸下降，15d仍然可檢測到,，且依然高于對照組,。

2．4手法觸診

所有實驗動物均存活且未見異常反應，4周后均有活動度,，8周后CHA-MSCs-VEGF組無活動度,，12周后2組均無活動度。

2．5影像學檢測

4周后均未見骨小梁,，8周后開始2組均可見骨小梁,。

2．6組織學檢測

CHA-MSCs-VEGF組術后12周有少量軟骨及大量的連續(xù)骨小梁形成,，可見皮質(zhì)骨圍繞，可見軟骨結(jié)構形成,，之后成骨,，成骨代謝活性已非常接近正常，植入材料與骨組織達到骨性融合,，自體髂骨組術后12周可見新生骨組織形成,，但其成骨能力不及CHA-MSCs-VEGF組。

2．7生物力學檢測

CHA-MSCs-VEGF組與自體組在大壓縮強度和彈性模量2方面差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,。

3討論

MSCs是近幾年來研究熱門的干細胞,，具有在一定的培養(yǎng)條件下，可以分化為骨細胞,，維持一定時期內(nèi)細胞的生長形態(tài)穩(wěn)定,、增殖速度較快、細胞的生存適應能力較強,、貼壁時間短,、成活率高等優(yōu)點，是目前骨組織工程中較為理想的種子細胞,。本實驗采用Percoll梯度離心法,，成功分離MSCs，并誘導其向成骨細胞分化,。支架物質(zhì)CHA是以特定的天然優(yōu)質(zhì)珊瑚為原料,，經(jīng)過一系列復雜的熱液置換反應，將珊瑚中的礦物質(zhì)轉(zhuǎn)換為羥基磷灰石并保留了珊瑚天然的孔隙,，得到物理結(jié)構和無機成分與人體骨相似的產(chǎn)物,，其不僅具有一定的機械強度和骨誘導物質(zhì)融合面積，而且其植入機體組織后有良好的生物相容性,，不產(chǎn)生局部或全身性毒性反應,，無炎癥排斥反應，具有良好的成骨潛能,。為了促進上述人工骨能更好地與機體組織融合,，本研究還加入了血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），其為機體內(nèi)促進血管生長的重要的生長因子,，在體內(nèi)外均可以特異性促進血管內(nèi)皮細胞的生長并誘導血管生成,。*，臨床骨折的愈合快慢與病損處血供有著密切的關系,，將VEFG基因轉(zhuǎn)染入人工骨的構建之中,，可促進骨組織血管的形成、加速骨質(zhì)間的融合和生長。本實驗中,，由觸診和影像學檢測發(fā)現(xiàn),，該基因增強人工骨在融合速度上快于自體髂骨，從組織切片上可看出,，其成骨的質(zhì)量上比自體髂骨更加成熟,，在生物力學的檢測中，該人工骨在大壓縮強度和彈性模量上均接近正常骨組織,。綜上所述,，CHA-MSCs-VEGF三聯(lián)人工骨復合物具有取材方便、培養(yǎng)簡單,、相容性好,、成骨迅速、生物力學強度高等優(yōu)點,，有望廣泛應用于臨床植骨融合手術中骨骼的替代材料。