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PCR實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)具體流程
PCR實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)具體流程
近日,，北京協(xié)和發(fā)布了病毒核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作流程的培訓(xùn)視頻，供其他符合條件的醫(yī)療機(jī)構(gòu)在開展病毒核酸檢測(cè)時(shí)參考,。儀器信息網(wǎng)特將其整理成文字版本供大家方便查看,。
一、個(gè)人三級(jí)防護(hù)穿戴
帶一次性帽子,、佩戴醫(yī)用N95,、一次性防護(hù)服、一次性鞋套,、一次性防水靴套,、一層乳膠手套、外層一次性隔離衣,、防護(hù)目鏡,、第二層乳膠手套、穿戴完畢后應(yīng)盡快通過緩沖間或者走廊,，進(jìn)入核酸提取區(qū)（業(yè)核酸提取實(shí)驗(yàn)室）,。
二、樣本滅活處理
核酸檢測(cè)須有兩名工作人員快速通過進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室,，進(jìn)行滅活實(shí)驗(yàn)操作,。生物安全柜內(nèi)需配備吸水棉與消毒酒精、有條件可配備吸水臺(tái)布,，對(duì)樣本溢灑時(shí)進(jìn)行緊急處理,；打開二級(jí)容器，用75%酒精消毒物體表面,，檢測(cè)樣本管密閉性后進(jìn)行滅活處理，滅活條件（56℃,，30min,，恒溫樣本滅菌儀等多種方式），取出酒精滅活管用酒精擦拭外表,，將樣本放入到生物安全柜內(nèi),。
三、手工核酸提取
操作人員進(jìn)入試劑配置區(qū)或者單獨(dú)的潔凈實(shí)驗(yàn)室,。
一,、試劑區(qū)準(zhǔn)備
根據(jù)說明說要求，在AW1中加入無水乙醇130mL,，在AW2中加入無水乙醇160mL,，計(jì)入無水乙醇后及時(shí)做好標(biāo)記,，在310μg的Carrier RNA中加入310μL AVE，并顛倒混勻使Carrier RNA充分溶解,，就此完成洗液AW1,、洗液AW2和Carrier RNA配置，而后通過傳遞窗傳送到樣本處理區(qū),，或者由人送到核酸提取實(shí)驗(yàn)室中,。
二、樣本的裂解
用1.5ml的無菌EP管,，移液器移取560μl AVL裂解液,，加入5.6μl Carrier RNA，加入140μl的已滅活的待提取核酸的待測(cè)樣本,，渦旋振蕩15s,，室溫靜止10min。將上述EP管放入離心機(jī)內(nèi)瞬時(shí)離心以去除可能殘留在EP管蓋上的裂解產(chǎn)物,，防止污染,。裂解完成后，加入560μl無水乙醇,，振蕩混勻15s,，將上述EP管放入離心機(jī)內(nèi)瞬時(shí)離心以去除可能殘留在EP管蓋上的裂解產(chǎn)物，防止污染,。
向離心柱加入裂解產(chǎn)物630μl,，8000轉(zhuǎn)離心1min，若離心機(jī)在生物安全柜之外,，每次使用都需進(jìn)行外表面消毒,。更換新廢液收集管，要從離心機(jī)中小心取出離心柱,，將上層離心柱轉(zhuǎn)移到新收集管中,，繼續(xù)將剩余裂解產(chǎn)物630μl加入離心柱中，若樣本體積大于140μl時(shí)需重復(fù)此步驟,，直到全部裂解產(chǎn)物都過柱離心,，8000轉(zhuǎn)離心1min，小心將離心柱轉(zhuǎn)移到新的收集管中,。
取500μl AW1加入離心柱中（注意,，此處加樣操作時(shí)務(wù)必將移液器吸頭接觸離心柱內(nèi)壁緩慢加樣），8000轉(zhuǎn)離心1min,。小心取出離心柱,，更換新的收集管。
取500μl AW2加入離心柱中，14000轉(zhuǎn)離心3min,，小心取出離心柱,，更換新的離心柱上端收集管，置于離心機(jī)中使用大轉(zhuǎn)速離心1min,，以確保將AW2中的殘液*離心干凈,。
取無菌1.5mlEP管收集核酸，將離心柱上端小心放入1.5mlEP管中,，取40-60μl的洗脫液AVE加入到離心柱中（注意：洗脫液應(yīng)盡量全部覆蓋住離心柱膜）,，用EP管管蓋蓋住離心柱，使用無菌剪刀剪去原離心柱管蓋,。
室溫靜止1min,，將其放入離心機(jī)中8000轉(zhuǎn)離心1min，回收核酸,。丟棄離心柱,，EP管中即為獲取的提取核酸，做好標(biāo)記與登記,。
四,、用儀器提取核酸
首先按照說明說準(zhǔn)備核酸提取試劑，將200μl滅活樣本添加到核酸提取試劑中,，根據(jù)核酸提取儀的設(shè)置程序上機(jī)提取核酸,，等儀器操作結(jié)束，提取核酸完成,，回收核酸,。
五、PCR體系配置
根據(jù)檢測(cè)樣本數(shù)量配制體系,，將配制好的PCR體系充分混勻并離心后,，將其通過傳遞窗送至樣本處理核酸加樣區(qū)，或單獨(dú)的樣本加樣實(shí)驗(yàn)室,。按照每孔分裝20μL反應(yīng)體系,，進(jìn)行分裝，在各孔分別加入5μL待測(cè)樣本核酸或陰陽對(duì)照物（請(qǐng)注意每次檢測(cè)器包含1個(gè)陽性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照且陰性對(duì)照需隨機(jī)分布）,，密封PCR管,，有條件時(shí)模板加樣盡量在單獨(dú)的生物安全柜進(jìn)行。
工作人員將配好的PCR管通過傳送窗口送至PCR擴(kuò)增區(qū),，或由人送至PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室,，上機(jī)檢測(cè),。
六,、上機(jī)檢測(cè)及結(jié)果分析
工作人員進(jìn)入基因擴(kuò)增分析實(shí)驗(yàn)室，從傳遞窗取出PCR反應(yīng)管,，上機(jī)前需混勻并離心反應(yīng)體系,，按試劑盒說明說設(shè)置擴(kuò)增參數(shù)并分析判讀結(jié)果,。分析結(jié)果時(shí)，嚴(yán)格閱讀說明說充分了解試劑盒靈敏度,、方法學(xué)局限性等綜合判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
為防止擴(kuò)增污染，反應(yīng)結(jié)束后的PCR擴(kuò)增管嚴(yán)禁開蓋并裝入密封帶中裝入的垃圾桶中,。
七,、檢測(cè)后的消毒處理
樣本處理完成后，工作人員應(yīng)用75%的酒精消毒處理外層手套并脫下外層手套,，放入生物安全柜中的生物垃圾桶中,。檢測(cè)完成后，生物安全柜臺(tái)面和地面應(yīng)用0.5-1%的有效氯消毒劑或75%乙醇進(jìn)行擦拭,。將安全柜內(nèi)產(chǎn)生的醫(yī)療垃圾用三層垃圾袋密封,，并將其放入垃圾桶中，垃圾袋上需標(biāo)記醫(yī)療垃圾信息,。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,，生物安全柜以及實(shí)驗(yàn)室均要進(jìn)行紫外燈照射消毒，時(shí)間至少30min,。
實(shí)驗(yàn)操作人員,，應(yīng)有他人用0.5-1%的有效氯消毒劑或75%乙醇對(duì)一次性隔離衣均勻噴霧消毒處理，而后脫去隔離衣將檢測(cè)醫(yī)用垃圾放入制定垃圾桶中,，工作人員在離開二級(jí)實(shí)驗(yàn)室后,，應(yīng)在緩沖區(qū)或走廊按順序摘脫個(gè)人三級(jí)防護(hù)用品，首先應(yīng)帶新的外層手套,，摘掉護(hù)目鏡并置于75%乙醇中消毒,，自上而下、自內(nèi)向外翻轉(zhuǎn)脫掉一次性防護(hù)服,，脫去外層手套,，摘除、一次性帽子,、脫一次性鞋套,。脫掉手套，病毒防護(hù)服均需進(jìn)行高壓滅菌處理,。高壓前后醫(yī)療垃圾嚴(yán)格區(qū)分,。
病毒相關(guān)垃圾需在120度，30min條件進(jìn)行濕熱高壓處理,，以高壓試紙條變色為有效,，而后作為普通醫(yī)療垃圾處理。