中瑞祥分光光度計(jì)儀器組成以及原理
儀器組成
分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器,。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量,。
儀器主要由光源、單色器、樣品室,、檢測(cè)器、信號(hào)處理器和顯示與存儲(chǔ)系統(tǒng)組成,。
原理
分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源,，通過(guò)系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源,，光線透過(guò)測(cè)試的樣品后,，部分光線被吸收，計(jì)算樣品的吸光值,，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比,。
單色光輻射穿過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長(zhǎng)度）成正比,，其關(guān)系如下式：
A=-lg(I/I0)=-lgT=kLc
式中 :A 為吸光度,；
I0為入射的單色光強(qiáng)度；
I 為透射的單色光強(qiáng)度,；
T 為物質(zhì)的透射率,；
k 為摩爾吸收系數(shù)；
L 為被分析物質(zhì)的光程,，即比色皿的邊長(zhǎng),；
c 為物質(zhì)的濃度；
物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收波長(zhǎng),，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù),。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測(cè)定其吸收度,即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量,。在可見(jiàn)光區(qū),，除某些物質(zhì)對(duì)光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒(méi)有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過(guò)處理使其顯色后再測(cè)定,故又稱比色分析,。由于顯色時(shí)影響呈色深淺的因素較多,，且常使用單色光純度較差的儀器，故測(cè)定時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r(shí)操作,。
常見(jiàn)用途
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率最高的功能,。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,，單鏈,、雙鏈DNA，以及RNA,。核酸的最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260 nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig,。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前，選擇正確的程序,，輸入原液和稀釋液的體積,，爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而,，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器,，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。
事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理,，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）,。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng),，都是正常的。另外,，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,，離子濃度等：在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高,，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移如TE,，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。,，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A,。在此范圍內(nèi)混合液不能存在氣泡,，空白液無(wú)懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈,；必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品,，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致,；不能采用窗口磨損的比色杯,；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。
