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細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無菌,、適宜溫度,、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等）,，使之生存,、生長,、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù),，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),。

不論對(duì)于整個(gè)生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來說,，細(xì)胞培養(yǎng)都是一個(gè)的過程,，細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的大規(guī)模克隆,。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡單的單細(xì)胞或j少分化的多細(xì)胞,，這是克隆技術(shù)的環(huán)節(jié)，而且細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的克隆,。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)研究方法中重要和常用技術(shù),，通過細(xì)胞培養(yǎng)既可以獲得大量細(xì)胞，又可以借此研究細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),、細(xì)胞的合成代謝、細(xì)胞的生長增殖等。

一,、細(xì)胞復(fù)蘇

將凍存細(xì)胞從液氮中取出后,，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化。移人15ml離心管中,，加入10ml預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基,，輕輕吹勻，離心,，2000rpmX2min,，棄上清液。

加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗,，棄上清液,。加入10ml DMEM培養(yǎng)基，輕輕吹打,，接種于10cm盤中,，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二,、細(xì)胞傳代

細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)．去培養(yǎng)基,，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶,，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min,。加人1ml DMEM培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管,。

加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤,，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min,，棄上清液,。再加入10ml PBS（經(jīng)高壓滅菌，保存于40C）,，吹勻,，吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照1×106/盤接種,，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),。

三、細(xì)胞凍存

細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí),，去培養(yǎng)基,，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min,。加入lmlDMEM培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤,，轉(zhuǎn)移至15ml離心管,，2000rpmX2min，棄上清液,。

加入lml凍存液（90%血清,，10%DMSO），放入凍存盒內(nèi)（盒內(nèi)有異bing醇,，以保證溫度降低的速度）,，立即放入一80℃冰箱內(nèi)，過夜,，第二天放入液氮中,，可以保存至少兩年，如不放人液氮,，可以保存三個(gè)月,。

凍存液的配制：70%的培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖,。

四,、注意事項(xiàng)

（1）進(jìn)入細(xì)胞間開始細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，必須嚴(yán)格按照下列步驟操作：

1.確定所有的細(xì)胞操作用的溶液和耗材都已經(jīng)消毒并檢測沒有問題,，不確定的溶液和耗材請(qǐng)勿使用,，除非特殊情況，不要借用別人的溶液,。

2.確定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)扎緊,。

3.確定酒精燈內(nèi)的酒精量，需要的話及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)充,。

4.確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置,。為了方便單手開啟瓶蓋，實(shí)驗(yàn)開始前可以把所有瓶蓋旋松,。

5.盡量不要直接傾倒溶液,，除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗,，溶液粘在瓶口,，請(qǐng)用噴過75%酒精的紙巾仔細(xì)清潔瓶口周圍（不要接觸到瓶口）后在火焰上簡單燒灼。

6.操作時(shí)如果不能肯定所用的耗材是潔凈的,，必須及時(shí)更換,。

7.實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)收拾，保持工作區(qū)域清潔整齊,，用75%酒精清潔臺(tái)面,。

（2）細(xì)胞污染的預(yù)防

1.實(shí)驗(yàn)用品防止污染,。細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑、耗材,、器材的清洗,、消毒，各種溶液滅菌要仔細(xì),，并在無菌實(shí)驗(yàn)檢測陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔,、消毒,、滅菌。

2.操作過程防止污染,。

3.穿著容易起靜電或吸附灰塵的衣物必須更換為白大褂后才能進(jìn)入細(xì)胞間,。

4.實(shí)驗(yàn)開始前需要確定戴的手套沒有問題，只要接觸過生物安全柜之外的物品,，必須及時(shí)對(duì)手套進(jìn)行消毒,。

5.進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)間后關(guān)好門，坐下來盡量少走動(dòng)以免影響生物安全柜的風(fēng)簾,。工作開始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋,。事先要嚴(yán)格檢查所用的器材、溶液和細(xì)胞,，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi),，更不能隨便使用，以免造成大規(guī)模污染,。

6.細(xì)胞操作時(shí)動(dòng)作要輕,，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口放在火焰周圍簡單轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼,，注意不要讓火焰把塑料瓶口燒化,。

7.實(shí)驗(yàn)操作時(shí)生物安全柜的隔板要盡可能放低，盡量減少談話,，打噴嚏或咳嗽時(shí)絕對(duì)不能對(duì)著工作區(qū),，以免造成不必要的污染。

8.瓶蓋應(yīng)當(dāng)?shù)狗旁谶h(yuǎn)離自己的地方,，以避免瓶蓋被誤操作所污染,。

9.不要從敞開的容器口上方經(jīng)過，以避免衣服上掉落不明物體對(duì)細(xì)胞的污染,。

10.實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要注意及時(shí)更換巴斯德吸管,、移液槍槍頭和移液管，切勿一根管子做到底,。一旦發(fā)現(xiàn)接觸了非潔凈或者無法確定潔凈的物品必須直接丟棄,。實(shí)驗(yàn)完畢應(yīng)及時(shí)收拾,，保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊，用75%酒精清潔臺(tái)面,。

（3）防止細(xì)胞交叉污染

1.在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí),，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，作上標(biāo)記便于辨別,。按順序進(jìn)行操作,，一次只處理一種細(xì)胞，多種細(xì)胞多種操作一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生t昆亂,。

2.在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí),，粘有細(xì)胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)基中污染其他細(xì)胞,。

3.所有細(xì)胞一旦購置,，或從別處引入，或自己建立,，必須及時(shí)保種凍存,，一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng),。