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細胞復蘇的主要步驟及注意事項
閱讀:464 發(fā)布時間:2024-11-5一,、主要步驟:
①將冷凍管從液氮中取出,迅速投入37℃水浴融化,,細胞融化后要盡快(約1min)移出37℃水浴,。37℃水浴時間延長會提高細胞死亡率,復蘇過程中一般細胞死亡率在20%~25%之間,。
②迅速用酒精棉球擦拭冷凍管外部殺菌消毒,,然后放置在冰浴上。
③小心開啟瓶蓋,,把細胞轉(zhuǎn)入含有4mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,,然后把培養(yǎng)瓶移至培養(yǎng)箱,36℃~38℃培養(yǎng)1h,,讓細胞貼壁,。
④細胞貼壁后,,小心移棄培養(yǎng)基,主要是去掉DMSO(懸浮生長細胞要通過離心沉淀除去DMSO),、死細胞及其碎片,,加5mL新鮮培養(yǎng)基,36℃~38℃培養(yǎng),。
⑤細胞培養(yǎng)24h后,,更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)直到形成單層,,便可以傳代。
⑥詳細記錄復蘇細胞的名稱,、數(shù)量,、復蘇時間、存放部位等,。
二,、注意事項:
1、注意無菌操作,。
2,、應(yīng)在1-2min內(nèi)使凍存液融化。如果復溫速度太慢,,則會造成細胞損傷,。另外,細胞復蘇后的操作最好在4℃冰浴中進行,,以減少冷凍保護劑對細胞的毒性,。
3、細胞復蘇過程中,,升溫的速率要大,,把從液氮或-70℃冰箱中取出的細胞在最短的時間內(nèi)放入水浴鍋。
4,、細胞放入水浴中注意用鑷子夾住細胞凍存管并在水浴中不時晃動,,使其受熱均勻,并防止水浴時水進入細胞凍存管污染細胞,。打開細胞凍存管之前要用酒精棉球?qū)龃婀芟静⒘栏伞?br style="box-sizing: border-box; margin: 0px; padding: 0px;"/>5,、液氮操作有一定的危險性,打開液氮罐取出細胞時,,戴上防護眼鏡,。