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在不附加任何保護(hù)劑下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶,，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷,、電解質(zhì)升高、滲透壓改變,、脫水,、PH 改變、蛋白變性等,，能引起細(xì)胞死亡,。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低,。在緩慢的凍結(jié)條件下,，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在﹣130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成,。

細(xì)胞凍存時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái),，待復(fù)蘇時(shí)重新進(jìn)入生長(zhǎng)分裂周期。

實(shí)驗(yàn)開始前,，將凍存管,、15 毫升離心管、移液管,、移液槍,、槍頭等放入無(wú)菌超凈工作臺(tái)，以紫外線照射 30 分鐘,。采用通風(fēng)機(jī)通風(fēng) 3 分鐘。以 75%酒精擦拭操作臺(tái)和雙手,。準(zhǔn)備好冰盒,。

將離心機(jī)調(diào)節(jié)至 800 轉(zhuǎn)，5 分鐘,。水浴箱調(diào)節(jié)至 37 度恒溫,。取細(xì)胞培養(yǎng)基、DMSO,、胰蛋白酶等,，放于水浴箱中預(yù)熱。

首先消毒雙手和超凈臺(tái),。取約 10ml細(xì)胞培養(yǎng)基放于 15 毫升離心管中,。

配置細(xì)胞凍存液：凍存液應(yīng)該提前配制，置于室溫備用,，防止臨時(shí)配制產(chǎn)生的熱量損傷細(xì)胞,，按無(wú)血清培養(yǎng)基 比 血清 比 DMSO=7:2:1 的比例配置細(xì)胞凍存液,，其中加大凍存液中血清的比例對(duì)于保存某些脆弱的干細(xì)胞以及一些比較珍貴的細(xì)胞很有好處的。

按比例加好凍存液組分后,，輕輕吸打混勻,，置于室溫下待用。

從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞,，進(jìn)行瓶口消毒,，棄去細(xì)胞原來(lái)的培養(yǎng)基。按每 25cm2/ml胰酶/EDTA 消化液比例加入消化液,，放入顯微鏡下觀察,，待所有細(xì)胞變圓后立即拿入超凈臺(tái)內(nèi)，加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)基以立即終止消化,。

采用無(wú)菌槍頭輕輕吹打細(xì)胞表面,，注意吹打全部培養(yǎng)表面，可以按照先左右吹打,，后上下吹打的方式,，取所有細(xì)胞懸液放入一干凈的15毫升離心管內(nèi)。

配平離心：采用天平配平兩端,，每分鐘 800 轉(zhuǎn),，室溫離心 5 分鐘。

采用羅氏 CASY-DT 快速細(xì)胞計(jì)數(shù)及活率分析儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),。加入 10ml CASY-ton至以標(biāo)記 viable 的管子中,，加入 100µl 細(xì)胞懸液，顛倒混勻三次,，可進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),。可見每毫升懸液中有活細(xì)胞總數(shù),。

取出凍存管,，注明細(xì)胞名稱、代數(shù),、日期,。

離心后，以無(wú)菌吸管吸棄上清液,，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀,。將細(xì)胞沉淀與凍存液充分混勻，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果,，將細(xì)胞總數(shù)調(diào)節(jié)至細(xì)胞數(shù)量為每毫升有 5×10?為宜,。

將細(xì)胞凍存懸液分裝入細(xì)胞凍存管中，一般一個(gè)兩毫升凍存管裝入 1 至 1.5 毫升細(xì)胞凍存懸液為宜,。

嚴(yán)密封口后,，進(jìn)行程序性降溫凍存：

首先 ﹣4 ℃ 30 分鐘,，20 ℃ 30 分鐘，﹣80 ℃過(guò)夜,，最后進(jìn)行液氮保存,。