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木聚糖酶活性測定方法分享
閱讀:570 發(fā)布時間:2024-7-3木聚糖是一種存在于植物細胞壁中的多糖類物質(zhì),是植物半纖維素的主要成分。
木聚糖酶分布廣泛,可以從動物、植物及微生物體內(nèi)獲得。
檢測原理:
木聚糖酶可以將底物木聚糖降解為寡糖和單糖,,具有還原性的寡糖和單糖在沸水浴的條件下,,能夠和DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)。
通過反應(yīng)溶液的顏色的變化,,來確定還原糖的含量,。
因為還原糖的生成量和反應(yīng)液的木聚糖活力是成正比的,通過分光光度法可以測定,,計算出樣品中的木聚糖酶活力,。
檢測所用的試劑:
乙酸溶液、乙酸鈉溶液,、氫氧化鈉溶液、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液,、木糖溶液,、木聚糖溶液,、DNS試劑,。
所需要的儀器設(shè)備:
碾缽,、分樣篩、分析天平,、pH計、磁力攪拌器,、電磁振蕩器,、離心機、恒溫水浴鍋,、分光光度計等,。
標準曲線:
吸取乙酸-乙酸鈉緩沖溶液4ml,,加入DNS試劑5ml,沸水浴加熱5min,,用自來水冷卻至室溫,,用水定容至25ml,制成標準空白樣,。
分別吸取木糖溶液1ml、2ml,、3ml、4ml,、5ml,、6ml,、7ml,,加入緩沖溶液定容至100ml,配制成0.1-0.7mg/ml的木糖標準溶液,。
按照上述的標準溶液配制,,分別做2次平行。吸取木糖標準溶液2ml,,分別加入2ml水和5mlDNS試劑。
電磁振蕩3s,,沸水加熱5min,,用自來水冷卻至室溫,,用水定容至25ml。
以標準空白樣作為對照,,在540nm處測吸光度OD值,。
以木糖濃度為Y軸,吸光度OD值為X軸,,繪制標準曲線。
檢測過程:
吸取10ml木聚糖溶液,,37℃平衡10min。
吸取10ml經(jīng)過稀釋的木聚糖酶溶液,,37℃平衡10min,。吸取2ml平衡過的木聚糖酶液,,加入5mlDNS試劑,,電磁振蕩3s。
加入2ml木聚糖溶液,,37℃保溫30min,。沸水浴加熱5min,,用自來水冷卻至室溫,,加水定容至25ml,電磁振蕩3s,。
以標準空白樣為空白對照,,在540nm處測定吸光度。以同樣的方法,,加入2ml的木聚糖酶,電磁振蕩3s,,37℃精確保溫30min,,加入5mlDNS試劑,電磁震蕩3s,,以終止酶解反應(yīng),。
沸水浴加熱5min,用自來水冷卻至室溫,,加水定容至25ml,,振蕩3s,以標準空白樣為空白對照,,在540nm處測定吸光度,。