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1,、細胞復蘇

將細胞凍存管從干冰中取出，立即放置37°水浴速融1min,，見無冰晶即可不再水?。ㄓ描囎幽萌。?/p>

將細胞凍存液加入10~15ml完培中,，吹打混勻,，減少DMSO對細胞毒性，800rpm離心5min

棄上清,，細胞沉淀進行下一步傳代,。

2、細胞傳代

試劑與材料（貼壁細胞）：

細胞：4T1乳腺癌細胞,；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1640培養(yǎng)基（含有生物素,、 維生素 B12、對氨基苯甲酸PABA,、高濃度的維生素肌醇和膽堿,；不含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或生長因子）,；血清：胎牛血清FBS（細胞營養(yǎng)液：提供基本營養(yǎng)物質(zhì),、提供激素和各種生長因子、提供結(jié)合蛋白,、提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷,、對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用）；胰酶（消化貼壁細胞促附著蛋白如層黏連蛋白,、纖維連接蛋白等）

實驗方法：

1）試劑解凍：胰酶,，培養(yǎng)基在37°水浴加熱解凍

2）制備培養(yǎng)基：1640培養(yǎng)基中加入10%的血清，水平搖勻,，避免震搖引起泡沫

3）細胞消化：將原來培養(yǎng)基倒除,，用500μl選擇pbs/胰酶先潤洗（消化培養(yǎng)基里的蛋白，避免對細胞生長產(chǎn)生影響）,，去除胰酶,，再沿壁（不直接加到細胞表面）加入1ml胰酶,，在37°中消化3~5min（可1min左右觀察消化情況）。

4）細胞傳代：加入3ml完培,，輕柔吹打,，取1/4的消化后的細胞（其余的倒掉）加至EP管，在細胞離心機上離心1000rpm 5min,，離心后的細胞,，輕柔放置，防止細胞混散,，可傾倒除去胰酶液（留一點點液體保持細胞活性）快速加入培養(yǎng)基,。以10CM培養(yǎng)皿為例：先在皿中加入7ml的培養(yǎng)基,。在EP管中懸空加入1~2ml左右培養(yǎng)基（60MM皿3ml培養(yǎng)基,；10CM皿10ml培養(yǎng)基），輕柔的吹打,，可以沿壁混合,，使黏附細胞變成單細胞；將細胞液加入至皿中,，劃10次8字使皿充分被浸潤,，放置37°孵育。

5）注意事項：

在進行細胞實驗前,，需紫外照射生物柜30min,，穿戴整齊后方可進入細胞房。

胰酶和培養(yǎng)基需37°水浴加熱,，至適合細胞生存溫度,。

開始實驗前，關(guān)閉紫外照射,，打開風櫥和燈光,。

開始實驗時，需要手消且所需物品需要消毒,，才可放入生物柜中,，臺面用酒精棉球消毒

物品擺放整齊，留出空間實驗,，右手用的在右手,，左手用的在左手，切勿交叉,。瓶蓋用前可擰松,，開口朝上或立放。每用完槍頭盒,，需蓋蓋,，且切勿雙手經(jīng)過槍頭盒,。實驗室，槍桿不要伸入瓶中或管中,。

實驗結(jié)束,，所用試劑需標簽；清理垃圾和廢液,；帶走自己的東西,；關(guān)閉燈光和通風櫥。

下一次傳代前,，顯微鏡中觀察細胞生長情況,，密度70%~80%左右，即可傳代,。

 

試劑與材料（懸浮細胞）

thp-1（人急性白血病單核細胞）——顯微鏡觀察時,，晃動皿，細胞游動,；1640培養(yǎng)基,，25培養(yǎng)瓶，10CM培養(yǎng)皿,，45mlEP管

實驗方法

轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿中的細胞至45mlEP管,，移液槍吹打（沿壁吹打，使之變成單個細胞）

1000rpm,，離心5min ,，得到細胞沉淀

快速傾倒上清液（沿細胞堆積的另一邊），保留500μl左右的液體

細胞沉淀加入4ml培養(yǎng)基（反復吹打）,，培養(yǎng)皿中加入7ml培養(yǎng)基（共10ml）,，25培養(yǎng)瓶中加入4ml培養(yǎng)基（共5ml）

重懸后細胞液分別移至培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶中，輕微搖晃,，放置37°恒溫箱