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脂質(zhì)體的制備
閱讀：897 發(fā)布時間：2023-5-4一、囊泡形成的機(jī)制
當(dāng)脂質(zhì)薄膜或脂質(zhì)結(jié)塊發(fā)生水合并且堆疊的液晶態(tài)雙層膜變得具有流動性和膨脹時，會形成脂質(zhì)體（脂質(zhì)囊泡）。水合的脂質(zhì)層在攪拌期間分離并自我密合形成龐大的多層囊泡（LMV），LMV可防止水與雙層膜的碳?xì)浠衔锖诵脑谶吘壈l(fā)生相互作用,。一旦形成這些顆粒，將需要聲能（超聲）或機(jī)械能（擠出）形式的能量輸入才能減小粒徑,。
二,、脂質(zhì)體制備方法
脂質(zhì)配方的性質(zhì)取決于具體成分（陽離子、陰離子和中性脂質(zhì)）,。但是,，同一種制備方法適用于所有成分的脂質(zhì)囊泡。制備流程的一般要素包括制備用于水合的脂質(zhì),、攪拌水合以及減小粒徑,，從而獲得均勻分布的囊泡。
A. 制備用于水合的脂質(zhì)
當(dāng)用混合脂質(zhì)成分制備脂質(zhì)體時,，必須先溶解脂質(zhì)并混合于有機(jī)溶劑中,，以確保獲得均勻的脂質(zhì)混合物。通常,，該過程使用氯/仿或氯/仿:甲醇混合液完成,。目的在于使脂質(zhì)混合，獲得澄清的脂質(zhì)溶液,。一般情況下,，脂質(zhì)溶液的制備濃度為10-20mg脂質(zhì)/ml有機(jī)溶劑，但是,，在脂質(zhì)溶解度和混合程度可接受的情況下,，也可使用更高濃度。一旦脂質(zhì)充分混合于有機(jī)溶劑中,，則除去溶劑以產(chǎn)生脂質(zhì)薄膜。如有機(jī)溶劑較少（< 1mL）,，可在通風(fēng)櫥內(nèi)使用干燥氮?dú)饬骰驓鍤饬髡舭l(fā)溶劑,。如有機(jī)溶劑較多,，應(yīng)通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，從而在圓底燒瓶內(nèi)壁形成脂質(zhì)薄膜,。將樣品瓶或燒瓶放在真空泵上過夜,，去除殘留有機(jī)溶劑，使脂質(zhì)薄膜干燥,。如果對使用氯/仿有異議,，也可以選擇使用叔丁/醇或環(huán)己/烷溶解脂質(zhì)。將脂質(zhì)溶液轉(zhuǎn)移到容器中,，并將容器放在干冰塊上或在干冰-丙酮或酒精（乙醇或甲醇）浴中旋轉(zhuǎn),，使其凍結(jié)。使用酒精浴時,，應(yīng)確認(rèn)容器能夠承受突然的溫度變化而不發(fā)生破裂,。隨后，將凍結(jié)的脂質(zhì)結(jié)塊放到真空泵上凍干,，直至干燥（1-3天,，具體取決于溶劑體積）。脂質(zhì)結(jié)塊的厚度不應(yīng)超過凍干容器的直徑,。干燥的脂質(zhì)薄膜或結(jié)塊可從真空泵上取下,，將容器牢固密封并冷凍儲存，直至用于水合,。
B. 脂質(zhì)薄膜/結(jié)塊的水合
只需在干燥脂質(zhì)的容器中加入水介質(zhì)并攪拌,，即可完成干燥脂質(zhì)薄膜/結(jié)塊的水合。水合介質(zhì)的溫度應(yīng)高于脂質(zhì)的凝膠-液晶相轉(zhuǎn)變溫度（Tc或Tm）,，在加入到干燥脂質(zhì)中之前具有最高Tc,。加入水合介質(zhì)后，脂質(zhì)懸浮液溫度在水合期間應(yīng)保持在Tc以上,。對于高轉(zhuǎn)變溫度的脂質(zhì),，只需將脂質(zhì)懸浮液轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，并將燒瓶放在無真空抽吸的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)系統(tǒng)上,。在溫度始終高于脂質(zhì)懸浮液Tc的溫水浴上旋轉(zhuǎn)圓底燒瓶,，可使脂質(zhì)在充分?jǐn)嚢璧牧鲃訝顟B(tài)下發(fā)生水合。水合時間取決于脂質(zhì)種類和結(jié)構(gòu),，但是,，強(qiáng)烈建議在劇烈振蕩、混合或攪拌條件下水合1小時,。此外,，在減小粒徑之前將囊泡懸浮液靜置過夜（老化），可以簡化減小粒徑過程并提高粒徑分布的均勻度,。不建議對高轉(zhuǎn)變溫度的脂質(zhì)進(jìn)行老化處理,，因為脂質(zhì)的水解會隨溫度升高而增加,。
水合介質(zhì)通常由脂質(zhì)囊泡的應(yīng)用決定。合適的水合介質(zhì)包括蒸餾水,、緩沖液,、生理鹽水和非電解質(zhì)溶液，如糖溶液,。建議體內(nèi)應(yīng)用采用生理滲透壓（290 mOsm/kg）,。滿足這些條件的普遍接受的溶液為0.9%生理鹽水、5%葡萄糖和10%蔗糖溶液,。在水合期間,，一些脂質(zhì)將形成結(jié)構(gòu)的復(fù)合物。當(dāng)使用低離子強(qiáng)度溶液水合時,，可觀察到高電荷脂質(zhì)形成粘性膠體,。縮略圖：通過添加鹽或減小脂質(zhì)懸浮顆粒的粒徑,，可緩解這個問題,。磷脂酰乙醇/胺等水合較差的脂質(zhì)傾向于在水合中自我聚集。脂質(zhì)囊泡包含超過60 mol%磷脂酰乙醇/胺,，可形成在囊泡周圍有一小層水合層的顆粒,。隨著顆粒相互靠近，阻擋顆?？拷乃吓懦庾饔孟?，兩層膜形成能量井，進(jìn)而粘附并形成聚集物,。聚集物從溶液中沉淀出來并形成龐大的絮狀物,，通過攪拌可使其分散，但靜置后將重新聚集,。水合產(chǎn)物是一種龐大的多層囊泡（LMV）,，結(jié)構(gòu)與洋蔥類似，每個脂質(zhì)雙分子層均被水層分離,。脂質(zhì)層之間的空間由多水合層成分填充,，其比由靜電排斥力分離的高電荷層靠得更近。一旦產(chǎn)生了穩(wěn)定的水合LMV懸浮液,，即可通過多種技術(shù)減小粒徑,，包括超聲法或擠出法。
C. 減小脂質(zhì)懸浮顆粒的粒徑
1. 超聲法
利用聲能（超聲法）破壞LMV懸浮顆粒,，通?？僧a(chǎn)生較小的單層囊泡（SUV），直徑范圍為15-50nm。最常見的超聲顆粒制備儀器是水浴超聲儀和探頭超聲儀,。杯-角型超聲儀盡管不常用,，但已成功制備SUV。探頭超聲儀可向脂質(zhì)懸浮顆粒傳輸高能量,，但會對脂質(zhì)懸浮顆粒過度加熱，導(dǎo)致降解,。超聲探頭會向脂質(zhì)懸浮顆粒中釋放鈦顆粒,，使用前必須通過離心將其去除。因此,，水浴超聲儀是SUV制備儀器,。通過將裝有懸浮液的試管放到水浴超聲儀中（或?qū)⒊曁筋^放到試管中），在超過脂質(zhì)Tc的溫度條件下超聲5-10分鐘,，即可完成對LMV分散系統(tǒng)的超聲處理,。脂質(zhì)懸浮液應(yīng)形成稍渾濁的透明溶液。渾濁是由懸浮液的殘留大顆粒誘導(dǎo)光散射造成的,。通過離心可去除這些顆粒,，從而獲得澄清的SUV懸浮液。平均粒徑和分布將受到成分和濃度,、溫度,、超聲時間和功率、體積和超聲儀調(diào)諧的影響,。由于超聲條件幾乎不可能復(fù)制,，因此，不同時間產(chǎn)生的不同批次通常具有粒徑差異,。此外,，由于這些膜高度彎曲，因此,，SUV本身并不穩(wěn)定,，當(dāng)儲存在低于其相轉(zhuǎn)變溫度的環(huán)境中時，將自發(fā)融合形成大型囊泡,。
2.擠出法
脂質(zhì)擠出法通過用力擠壓脂質(zhì)懸浮液,，使其通過孔徑的聚碳酸酯濾膜，從而產(chǎn)生粒徑與所用濾膜孔徑相近的顆粒,。在擠壓通過最終孔徑濾膜之前,，可通過多次凍融循環(huán)或使用較大孔徑濾膜（通常為0.2µm-1.0µm）預(yù)先過濾懸浮液，使LMV懸浮顆粒破碎,。該方法有助于防止膜污染并提高最終所得懸浮液的粒徑分布均一性,。與所有減小LMV分散系統(tǒng)粒徑的方法相同，擠出法采用的溫度應(yīng)高于脂質(zhì)的Tc。若擠出溫度低于Tc,，則濾膜可能會被無法通過膜孔的硬質(zhì)膜堵塞,，導(dǎo)致擠出失敗。使用孔徑為100nm的濾膜擠出,，通?？僧a(chǎn)生較大的單層囊泡（LUV），平均孔徑為120-140nm,。平均粒徑還取決于脂質(zhì)成分,，并且具有非常高的批次間重現(xiàn)性。