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簡介

從林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中純化得到,。據(jù)資料顯示：該酶有兩個Ca2+結合位點,，它們離酶的活性中心有一定距離,，與催化機理并無直接關系。然而,，如果從該酶中除去Ca2+,，由于出現(xiàn)遠程的結構變化，催化活性將喪失80%左右,，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染酸制品的蛋白質,。所以，蛋白酶k消化過程中通常加入EDTA（以抑制依賴于Mg2+的核酸酶的作用）,。但是,，如果要消化對蛋白酶k具有較強耐性的蛋白，如角蛋白一類,，則可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的緩沖液,。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至終濃度為2mmol/l,以鰲合Ca2+,。

蛋白酶K,，是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵,。此酶經(jīng)純化去除了RNA酶和DNA酶活性,。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定，還具有降解天然蛋白質的能力,，因而它應用很廣泛,，包括制備脈沖電泳的染色體DNA,，蛋白質印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml,。在較廣的pH范圍內(nèi)（pH 4-12.5）均有活性,。

推薦反應緩沖液：50mMTris-HCl(pH7.5),10mM CaCl2 。

蛋白酶K配制標準：20mg/ml蛋白酶K配制標準（proteinase K）：將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中,，輕輕搖動，直至蛋白酶K*溶解,。不要渦旋混合,。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃,。

作用

值得注意的是,，蛋白酶K在原位雜交技術中通常用于雜交前的處理,它具有消化包圍靶DNA蛋白質的作用,以增加探針與靶核酸結合的機會,提高雜交信號.但蛋白酶K的濃度過高、消化時間過長或孵育溫度過高時,都會對細胞的結構有一定的破壞,導致組織切片的脫落,細胞核的消失,從而影響雜交結果.EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用,解決上述出現(xiàn)的問題,并能達到理想的染色效果,。

保存方法

保存：保存在－20℃冰箱里,，避免反復凍融，有效保證12月,。

孵育溫度為55至65℃,，理想孵育溫度為58℃，孵育時間為15分鐘至48小時,；理想孵育時間為2小時,。