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ELISA實(shí)驗(yàn)技巧：酶標(biāo)板分類(lèi)與性能判斷
閱讀：1786 發(fā)布時(shí)間：2021-7-7酶標(biāo)板作為ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中的輔材,，起著舉足輕重的作用并直接影響最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，酶標(biāo)板的好壞主要取決于其對(duì)蛋白吸附的靈敏度,、板孔間蛋白吸附能力差異以及所采購(gòu)酶標(biāo)板批次間的差異。因此,，選擇一款蛋白吸附靈敏度高,、對(duì)蛋白吸附能力孔間差異小、批次間差異小的酶標(biāo)板產(chǎn)品,，是實(shí)驗(yàn)者獲得可靠,、穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的保障。
酶標(biāo)板分類(lèi)：根據(jù)不同的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),，酶標(biāo)板有著不同的分類(lèi),。
一、根據(jù)孔數(shù),，可分為96孔,、48孔等，由于酶標(biāo)板主要是配合酶標(biāo)儀用,，目前市面上的酶標(biāo)儀最多為96孔,，因此酶標(biāo)板最為常用的也是96孔。
二,、根據(jù)其底部的不同,，又分為平底的，U型底,、V型底等,。平底的折射率低，適于在酶標(biāo)儀檢測(cè),；U型底的酶標(biāo)板折射率較高,，方便加樣、吸樣,、混勻等操作,，可以不用放在酶標(biāo)儀上，直接通過(guò)目測(cè)觀察顏色變化情況,，從而判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng),。V底的酶標(biāo)板可以精確的吸取樣品,。
三,、根據(jù)酶標(biāo)板與蛋白和其它分子結(jié)合能力的不同,，又分為高結(jié)合力、中結(jié)合力和氨基化等,。
1） 高結(jié)合力
此種酶標(biāo)板,，表面經(jīng)處理后，其蛋白結(jié)合能力大大增強(qiáng),，可達(dá)300~400ng IgG/cm2,，主要結(jié)合的蛋白分子量＞10kD。使用該類(lèi)酶標(biāo)板可提高敏感性,，并可相對(duì)減少包被蛋白的濃度和用量,，不足之處為較易產(chǎn)生非特異性反應(yīng)?？乖蚩贵w包被后,，以非離子去污劑無(wú)法有效地封閉未結(jié)合蛋白的部位，需使用蛋白作為封閉劑,。
（2) 中結(jié)合力
此類(lèi)酶標(biāo)板經(jīng)表面疏水鍵被動(dòng)與蛋白結(jié)合,，適合作為分子量＞20kD的大分子蛋白的固相載體，其蛋白結(jié)合能力為200~300ng IgG/cm2,。由于該類(lèi)酶標(biāo)板所具有的僅與大分子結(jié)合的特性,，適用于作為未純化抗體或抗原的固相載體，可降低潛在的非特異性交叉反應(yīng),。該類(lèi)板可以惰性蛋白或非離子去污劑作為封閉液,。
（3)氨基化
這種酶標(biāo)板經(jīng)表面改性處理后擁有帶正電荷的氨基，其疏水鍵由親水鍵取代,。該類(lèi)酶標(biāo)板適合作為小分子蛋白的固相載體,。使用合適的緩沖液和pH值，其表面可通過(guò)離子鍵與帶負(fù)電荷的小分子結(jié)合,。由于其表面的親水特性和可通過(guò)其它交聯(lián)劑共價(jià)結(jié)合的能力,，可用于固定溶于Triton-100、Tween 20等去污劑的蛋白分子,。該類(lèi)板的缺陷為由于降低了疏水性,，一部分蛋白分子無(wú)法結(jié)合；此外,，其表面需有效地封閉,。由于親水和共價(jià)的表面特性，使用的封閉液必須能夠與非反應(yīng)性氨基基團(tuán)和所選擇的交聯(lián)劑中任何功能基團(tuán)發(fā)生作用,。
四,、根據(jù)顏色可分為透明、黑色、白色,。
透明的是常用的,，用于最一般的酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)。相對(duì)于透明的的酶標(biāo)板,，還有用于發(fā)光檢測(cè)用的不透明的酶標(biāo)板,，一般有黑色和白色兩種。黑色的酶標(biāo)板自身會(huì)有光吸收,，所以它的信號(hào)相對(duì)于白色酶標(biāo)板要低很多,，因此一般用于檢測(cè)較強(qiáng)的光，如熒光檢測(cè),。而白色的酶標(biāo)板就用于較弱的光檢測(cè),，常用于一般的化學(xué)發(fā)光。另外黑色的酶標(biāo)板還可以消弱非特異反應(yīng)帶來(lái)的問(wèn)題,。同時(shí)需要注意的是,，用一般的酶標(biāo)板不可以進(jìn)行發(fā)光檢測(cè)，因?yàn)橐话銖幕瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)中發(fā)射出的光是各向同性,，如果用透明的酶標(biāo)板,，光不僅會(huì)從垂直方向發(fā)散，還會(huì)從水平方向發(fā)散,，使得光極易通過(guò)各個(gè)孔之間的間隙和孔壁,，從而導(dǎo)致各孔的光吸收值受到相鄰孔發(fā)射光的影響。
酶標(biāo)板性能判斷
良好的酶標(biāo)板應(yīng)該是吸附性能好,，空白值低,，孔底透明度高，各板之間,、同一板各孔之間性能相近,。酶標(biāo)板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大,，因此,，每一批號(hào)的酶標(biāo)板在使用前須事先檢查其性能。
常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔,，洗滌后每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體,，保溫后洗滌，加底物顯色,，終止酶反應(yīng)后,，分別測(cè)每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件,，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計(jì)算全部讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差,，應(yīng)小于10%,。以下以A、B,、C三款酶標(biāo)板為例,。
直接法：檢測(cè)Human IgG在酶標(biāo)板表面的吸附
雙抗體夾心法：包被山羊抗人抗體檢測(cè)陽(yáng)性血清中抗原
由上圖可以看出,，這三類(lèi)酶標(biāo)板中,，A類(lèi)酶標(biāo)板具有更好的蛋白吸附效果，同時(shí)也提高蛋白吸附的靈敏度,，能夠提供更為可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),。
另外，可以詢(xún)問(wèn)酶標(biāo)板的批內(nèi)差異,，以下是某款酶標(biāo)板的批內(nèi)差異,。
由批內(nèi)差異數(shù)據(jù)圖可以看出，該酶標(biāo)板具有很好地批間穩(wěn)定性,，批內(nèi)變異系數(shù)（CV）差異均在5.0％附近,，明顯低于業(yè)內(nèi)關(guān)于臨床免疫反應(yīng)用酶標(biāo)板的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中批內(nèi)變異系數(shù)低于10.0%的要求，因此也適合用于ELISA實(shí)驗(yàn),。