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1.細胞吸除培育瓶內(nèi)舊培育液,。

 

2.參加無菌pbs洗液（5-8mL）悄悄潤濕細胞,，稀釋多余的培育基，之后吸走洗液,，動作要輕,，不可吹打到細胞。

 

3.向瓶內(nèi)參加含0.25%EDTA的胰蛋白酶混合液少許,，以能覆滿瓶底為限,。 

 

4.置溫箱中2~5分鐘，一旦鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮,，細胞間隙增大后,，細胞變圓，比較松動后,，當即終止消化,。
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5.參加該細胞對應(yīng)的培育基6mL（T25培育瓶）或12mL（T75培育瓶）終止消化。

 

6.用吸管通過吸取的培育基悄悄反復(fù)吹打瓶壁細胞,，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液,。吹打時應(yīng)盡量以少的次數(shù)將細胞從壁上吹下，不只要操控吹打的力度,、次數(shù),，還要留意要將細胞盡可能吹成單個。這樣既能削減死細胞,，又能便于細胞再次均勻貼壁成長,。

 

7.依據(jù)傳代份額,，將細胞懸液分瓶，再補充培育基后,，靜置于溫箱培育,，直止貼壁。

 

貼壁細胞在培育瓶長成致密單層后,，持續(xù)成長的空間缺乏,，培育基中的養(yǎng)分成份也耗費較多，同時代謝廢物也有較多堆積,，需要分瓶培育,，對細胞進行傳代擴增。關(guān)于貼壁不太緊的細胞如293,，能夠直接吹散后分瓶,。而關(guān)于貼壁較緊的細胞如CHO，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶,。

 

關(guān)于懸浮細胞換液時只需要補液就行,。

 

懸浮細胞的傳代則不需要用胰酶消化，直接通過計數(shù)算好傳代的份額,，直接分瓶,，補液。有些懸浮細胞趨于成團成長,，此刻細胞成長狀態(tài)杰出,，當補液時，防止吹打,。