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一,、爬片的準(zhǔn)備

1.爬片可用一般的蓋玻片,，也可用爬片；

2.應(yīng)用蓋玻片,，可根據(jù)自己的需要剪裁成合適的大小，以備置于6孔板,、12孔板或24孔板,；裁剪時(shí)可用前護(hù)士輸液用于打開玻璃安瓶的小沙輪，或者是口腔科的那種小沙輪,，輕輕劃一下后,，稍用力一掰就分開了。

如果接種大皿的話,，我一般不將蓋玻片切開,，直接清潔后放入培養(yǎng)皿中，到染色時(shí)再將之切開,，這樣既保證了細(xì)胞均一性,，又可同時(shí)做幾個(gè)指標(biāo)的染色。

3.將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過夜,，第二天先用自來水沖洗20遍,，再置于無水酒清中浸泡6小時(shí)，再用三蒸水沖洗3遍,，放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進(jìn)行高壓消毒,。

4.高壓后取出放入烤箱中烤干，備用,?？靖珊罂煞湃氤瑑襞_中。

5.關(guān)于多聚賴氨酸,，很多人都將玻片用此處理,，以使細(xì)胞與玻片結(jié)合更牢。但我在做爬片時(shí)從來沒用過多聚賴氨酸,，細(xì)胞貼壁仍然很好,，且在做后續(xù)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色、TUNEL等凋亡檢測,、免疫熒光等也從未脫過片,。

 

二、細(xì)胞爬片 

1.胰酶消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)重懸細(xì)胞于*培養(yǎng)基中,。

2.加細(xì)胞時(shí),，根據(jù)玻片的大小，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基,，目的是使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，然后放玻片，防止加細(xì)胞懸液時(shí)玻片漂起,，造成雙層細(xì)胞貼片,。整個(gè)過程注意無菌操作。

3.根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入培養(yǎng)板內(nèi)即可

4.待細(xì)胞貼壁后,，可去上清加含藥培養(yǎng)基,。

5.按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，作用一定時(shí)間后取玻片,。取玻片時(shí)由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,，張力較大，我一般將注射器針頭針尖向背面弄個(gè)小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起,，用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h,，48h,，72h等這樣時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)的話,，將所需數(shù)量的爬片取出時(shí)應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續(xù)培養(yǎng),。

 

三,、細(xì)胞爬片的固定

細(xì)胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍,，然后再做固定,。當(dāng)然，根據(jù)研究目的,，PBS洗也不是一定要做的,，比如做凋亡的TUNEL染色時(shí)就避免洗，因?yàn)榈蛲龅募?xì)胞在洗的過程中有可能會脫落,。

另外在保存細(xì)胞爬片的時(shí)候,，我一般用培養(yǎng)皿或板，先在皿底放一層面巾紙,，然后再放爬片,，這樣方便做實(shí)驗(yàn)時(shí)取片。然后蓋上蓋子,，并在蓋子上做標(biāo)記,，為避免混淆，可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起,。一般-20℃保存2-3個(gè)月的片子做免疫組化是沒有問題的,。