T7高收率RNA合成試劑盒優(yōu)化轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,，利用T7 RNA聚合酶，以T7啟動(dòng)子序列為模板的線性雙鏈DNA,，以NTPs為底物控制啟動(dòng)子下游DNA序列,，高效合成單鏈RNA。在轉(zhuǎn)錄過程中,，修飾過的核苷酸可以加入底物中制備生物素或染料標(biāo)記RNA,。T7 Co-transcription RNA Synthesis Kit 進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的優(yōu)化，試劑盒使用T7 RNA聚合酶并以含有T7啟動(dòng)子序列的線型雙鏈DNA為模板,，以NTPs為底物,，對啟動(dòng)子下游的DNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，高效合成單鏈RNA,。轉(zhuǎn)錄時(shí)可在底物中加入修飾的核苷酸,，制備生物素或染料標(biāo)記的RNA。

產(chǎn)品信息：

產(chǎn)品組分：

T7 RNA Polymerase Mix,、10xTranscription Buffer、ATP/CTP/GTP/N1-Me-PUTP,、CAP GAG,、質(zhì)粒DNA模板

試劑盒中帽類似物可進(jìn)行選擇，惠誠生物可提供帽類似物:CAP GAG,、CAP GAG (3'OMe),、CAP GAU、CAP GAG(m6A)以及新型帽類似物CAP4,、CAP5,、CAP7、CAP8,、CAP 等

以下成分以EasyCаp™ GAG  m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG 100mM Ammonium solution, GMP grade 貨號:CAP3011為例：

常見問題解答：

1. 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量低

模板的質(zhì)量與成品率密切相關(guān),。試驗(yàn)組的產(chǎn)量顯著低于對照組，可能的原因有:①實(shí)驗(yàn)?zāi)０搴幸种瞥煞?模板有問題,。

建議:①重新純化模板;②確定模板定量及其完整性;③延長反應(yīng)時(shí)間;④增加模板輸入量;⑤嘗試其他啟動(dòng)子和RNA聚合酶,。

2. 短轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量低

短轉(zhuǎn)錄起始片段會(huì)抑制該反應(yīng)。當(dāng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物小于100 nt時(shí),，延長反應(yīng)時(shí)間至4-8 hs或增加模板量至2 μg均可提高RNA產(chǎn)量,。

3.RNA轉(zhuǎn)錄長度大于預(yù)期

如果電泳顯示產(chǎn)物條帶大于預(yù)期條帶，可能的原因是:①質(zhì)粒模板可能沒有完(空)全線性化;②感覺鏈3’端結(jié)構(gòu)突出;③RNA具有未完(空)全變性的二級結(jié)構(gòu),。

建議:①檢查模板是否完(空)全線性化,，必要時(shí)進(jìn)行額外線性化;②選擇合適的限制性內(nèi)切酶，避免3'外翻，或使用Klenow Fragment /T4 DNA聚合酶完成轉(zhuǎn)錄后再繼續(xù);③用變性凝膠檢測RNA產(chǎn)物,。

4. RNA轉(zhuǎn)錄長度低于預(yù)期

如果電泳顯示產(chǎn)物條帶小于預(yù)期大小,，可能的原因是:①模板中含有類似于T7 RNA聚合酶的終止序列;②模板中GC含量較高。

建議:①降低反應(yīng)溫度(如30℃),。有時(shí)降低溫度可以增加轉(zhuǎn)錄長度,，但會(huì)降低產(chǎn)量?；蛘邍L試不同的RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄;②若模板GC含量較高,，可采用42℃轉(zhuǎn)錄，或添加SSB以增加產(chǎn)量和轉(zhuǎn)錄長度,。

5. 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的電泳跟蹤

電泳過程中出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,。可能原因:①實(shí)驗(yàn)操作過程中被RNase污染;②RNase污染DNA模板,。

建議:①使用不含RNase的移液針尖和EP管,，佩戴一次性乳膠手套和口罩，所有試劑均使用不含RNase的H2O制備,。②重新純化模板DNA,。

相關(guān)探針產(chǎn)品推薦：

mRNA 帽子類似物 Cаp GAG GAG (3'OMe) Cap GAU CAP 5

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