人NK細(xì)胞培養(yǎng)基（套裝）

人NK細(xì)胞無血清無動物成分培養(yǎng)基操作說明

【實驗材料】

1. KXAcF擴(kuò)增液（1L,，貨號：kx40-202）

2. 激活劑濃縮液（0.5ml，貨號：kx40-201）

3. 重組人白介素-2

4. 重組人白介素-15

5. 細(xì)胞培養(yǎng)瓶

6. 細(xì)胞培養(yǎng)袋

7. 人淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-Hypaque,，比重1.077g/ml）

8. 生理鹽水或PBS（PH 7.2）

9. 注射器及其它細(xì)胞培養(yǎng)用材料

【操作方法】

1. 激活劑預(yù)處理

  推薦的處理方案

注意：一般而言，臍血單個核細(xì)胞濃度是外周血的一倍左右,。

      通常使用的臍血采集袋中含抗凝劑 28ml/袋

1. 吸取激活劑75ul,，加至1個25cm²培養(yǎng)瓶中。加入PBS 5ml充分混勻,，使液體分散在瓶底,。
2. 吸取激活劑250ul，加至1個75cm²培養(yǎng)瓶中,。加入PBS 10ml充分混勻,，使液體分散在瓶底。
3. 或吸取激活劑500ul,，加至1個175cm²培養(yǎng)瓶中,。加入PBS 20ml充分混勻，使液體分散在瓶底,。
4. 或吸取激活劑1ml,，加至1個250cm²培養(yǎng)瓶中。加入PBS 40ml充分混勻，使液體分散在瓶底,。

注：飽和濃度的激活劑利于NK細(xì)胞的特異性活化,。

1. 4℃活化過夜；或置于4℃冰箱保存,，可儲存2周,。
2. 吸除激活劑，沿培養(yǎng)瓶側(cè)壁加入生理鹽水,，輕輕晃動培養(yǎng)瓶,，使液體充分分散。特別強(qiáng)調(diào)：側(cè)壁加入生理鹽水,。
3. 吸除生理鹽水,，洗滌后的培養(yǎng)瓶應(yīng)立即使用。

提示：

• 使用PBS稀釋激活劑,，可維持激活劑工作液的PH值,，從而保證抗體與培養(yǎng)瓶底的充分結(jié)合
• 必要時，可在37℃條件下反應(yīng)至少1小時,，但效果較差,，常影響終NK細(xì)胞比例。增加激活劑活化時間,，?？蛇_(dá)到較好的效果。

2. 外周血采集

準(zhǔn)備材料：50ml注射器,，注射用肝素鈉溶液（2ml,，12500U）

操作步驟：

1. 50ml注射器連接靜脈輸液針，去除輸液針保護(hù)套,，抽取肝素鈉1ml浸潤管壁,，推出殘留液體。
2. 肘靜脈處皮膚消毒,，抽取30-50ml外周血,。
3. 套上輸液針保護(hù)套，在針頭近端將軟管打結(jié)封閉靜脈輸液針,。
4. 核對姓名的信息,，標(biāo)記。
5. 一次性鋪巾包裹注射器,，至于血液標(biāo)本采集箱,，室溫運(yùn)輸。
6. 3小時內(nèi)交給實驗室技術(shù)人員,。

3. 臍帶靜脈血采集

按照臍靜脈血采集常規(guī),，使用血液采集袋采集,。

4. 單個核細(xì)胞分離、血漿采集及處理

1. 開啟水浴箱,，調(diào)整溫度至56℃以備滅活補(bǔ)體,。
2. 采集常規(guī)外周血、臍帶血或G-CSF動員的外周血,。
3. 離心,，500g，10分鐘,，收集血漿,。56℃,，20-30分鐘滅活補(bǔ)體,。
4. 稀釋血細(xì)胞，F(xiàn)icoll-Hypaque密度梯度離心,，800g（2000rpm左右）,，30分鐘。
5. 在收集單個核細(xì)胞層之前,，將血漿離心,，800g，5分鐘以上,，以去除其中的血小板,。
6. 收取單個核細(xì)胞層，充分混勻,。離心洗滌,，500g，6-10分鐘（根據(jù)液體量調(diào)整）,。
7. 再次離心洗滌,，500g，6-10分鐘（根據(jù)液體量調(diào)整）,。
8. 用KXAcF擴(kuò)增液懸浮細(xì)胞,。
9. 取10ul細(xì)胞懸浮液，加入白細(xì)胞稀釋液90ul,，或3%冰醋酸90ul,，混勻后計細(xì)胞數(shù)。

5. 細(xì)胞培養(yǎng)

1)  單個核細(xì)胞懸液中加入IL-2,，500-1000U/ml,，IL-15，25-50ng/ml,，自體血漿5-10%,。細(xì)胞濃度調(diào)整至2*10⁶/ml,，

A：細(xì)胞初始接種濃度是影響終NK細(xì)胞比例及細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的關(guān)鍵因素之一。根據(jù)經(jīng)驗,，細(xì)胞終濃度2*10⁶/ml為宜,。

B：某些外周血，血漿十分渾濁,，其中的脂類含量過高,，不利于細(xì)胞增殖?？蓳Q用混合人AB血漿,。

2)  將細(xì)胞懸液加入已經(jīng)預(yù)鋪板、且已經(jīng)洗滌一次的培養(yǎng)瓶中,，37℃,，5%CO2和100%濕度下培養(yǎng)。次日,，觀察是否有污染現(xiàn)象,；如無，繼續(xù)培養(yǎng),，無需反復(fù)觀察,。

3)  72小時后，根據(jù)細(xì)胞密度,，加入適量IL-2,，500-1000U/ml，IL-15,，25-50ng/ml,，自體血漿10%的擴(kuò)增培養(yǎng)基。一般情況下,，補(bǔ)充液體量為原體積的一倍,。IL-2和IL-15按照補(bǔ)液后的總體積計算，血漿按照新培養(yǎng)基體積計算,。

4)  繼續(xù)培養(yǎng)2天,，培養(yǎng)液中補(bǔ)充適量含血漿5-10%，IL-2（500-1000U/ml）和IL-15（25-50ng/ml）的新鮮擴(kuò)增培養(yǎng)基,。補(bǔ)液量一般為原體積的一倍,。

5)  之后，每天觀察細(xì)胞集落大小及密度,，及時補(bǔ)充含血漿,、IL-2和IL-15的新鮮培養(yǎng)基。

提示：

A：早期細(xì)胞增殖速度較慢,，這與NK細(xì)胞的特異性活化有關(guān),。一般而言,，NK細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞的比例為5-15%，NK細(xì)胞擴(kuò)增一倍,，細(xì)胞總數(shù)只擴(kuò)增1.2倍,。因此，早期細(xì)胞總數(shù)并不能反映細(xì)胞擴(kuò)增速度,。

B：轉(zhuǎn)大瓶或轉(zhuǎn)袋培養(yǎng)是NK細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟之一,。經(jīng)過72小時培養(yǎng)后，部分NK細(xì)胞形成貼壁的集落,；而且,，這些貼壁的集落常分布于培養(yǎng)瓶底的邊沿。如經(jīng)5-6次吹打后,，NK細(xì)胞集落未脫落,，則在原培養(yǎng)瓶中加入含5-10%血漿、IL-2（500-1000U/ml）和IL-15（25-50ng/ml）的新鮮擴(kuò)增培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2-3天,，則大部分集落可自行脫落,。收集這些細(xì)胞，與其他細(xì)胞轉(zhuǎn)入大培養(yǎng)袋或大培養(yǎng)瓶中混合培養(yǎng)即可,。

 附圖1.實際直徑接近或超過250um的NK細(xì)胞集落，集落貼壁生長,。

      尺寸：100um,。

6）繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞總體積超過200ml,，細(xì)胞數(shù)超過2x10⁸個,。此時，可轉(zhuǎn)大培養(yǎng)袋培養(yǎng),，培養(yǎng)體積擴(kuò)大一倍,。新鮮擴(kuò)增培養(yǎng)基中含IL-2（500-1000U/ml）和IL-15（25-50ng/ml）補(bǔ)充自體血漿。

7）每隔2-3天補(bǔ)充含新鮮的血漿及細(xì)胞因子的培養(yǎng)基,，培養(yǎng)12-15天細(xì)胞,，達(dá)到目的用量后，可進(jìn)行質(zhì)量檢驗,，之后收獲細(xì)胞,。

提示：

A．每次補(bǔ)液時，均添加IL-15可提高NK細(xì)胞比例,，但也增加了培養(yǎng)成本,。

B．如在培養(yǎng)后期無自體血漿可用，可補(bǔ)充人AB血漿,，但是需要滅活補(bǔ)體,。

C．對于1.8L培養(yǎng)袋而言,，如400ml培養(yǎng)基平鋪整個培養(yǎng)袋，則不能維系細(xì)胞間相互支持作用,。建議折疊一半培養(yǎng)袋,，使培養(yǎng)基集聚于另一半。依據(jù)經(jīng)驗,，這樣可更好的維系細(xì)胞的快速增殖,。

6. 細(xì)胞收獲

1）將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，計細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞活力,。

2）將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至250ml離心管,，離心收獲細(xì)胞，離心速度為1500rpm (500xg),，離心時間為10分鐘,。

3）將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50ml離心管，生理鹽水懸浮,，離心洗滌2次,，1500rpm (500xg)，6分鐘,。

4）用含1%注射用人白蛋白的生理鹽水懸浮細(xì)胞。

5）70μm細(xì)胞篩過濾細(xì)胞,。

1. 留小樣備質(zhì)檢,。
2. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至輸液袋中,。靜置于室溫,。

7. 注意事項

1）初始接種單個核細(xì)胞的濃度以及細(xì)胞的活性,，不但影響終細(xì)胞群NK細(xì)胞比例,，也影響培養(yǎng)過程中細(xì)胞的活性。過低的單個核細(xì)胞接種濃度,，細(xì)胞增殖速度慢,；過高的濃度,，終細(xì)胞群中NK細(xì)胞比例低,。

2）在小培養(yǎng)袋或大培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),，總體積200ml，細(xì)胞總數(shù)在2*10⁸以上時,，方可轉(zhuǎn)入大培養(yǎng)袋,。否則,，細(xì)胞增殖速度慢,，終細(xì)胞總數(shù)低,。

3）體系中持續(xù)添加IL-15,，可維系NK細(xì)胞優(yōu)勢擴(kuò)增,。

4）NK細(xì)胞增殖速度個體差異很大，轉(zhuǎn)大瓶或轉(zhuǎn)袋培養(yǎng)后,，應(yīng)密切觀察細(xì)胞生長狀態(tài),。由于NK細(xì)胞常呈集落形式增殖,，細(xì)胞計數(shù)準(zhǔn)確不高,。建議根據(jù)培養(yǎng)基顏色（由紅色變橙色），每10x10視野中實際直徑接近或大于250um的集落平均達(dá)到3-5個,，即應(yīng)補(bǔ)加新鮮的擴(kuò)增培養(yǎng)基,。同樣,，培養(yǎng)基中應(yīng)添加適量血漿,、IL-2和IL-15.

附圖2.培養(yǎng)基顏色和集落大小，是決定換液及換液量的關(guān)鍵因素,。左圖：左側(cè)為剛補(bǔ)液的培養(yǎng)基顏色,，右側(cè)為需要補(bǔ)液的液體顏色,。右圖：a和b:大集落,；c和d:小集落,。