大鼠血小板衍生生長因子(PDGF)ELISA試劑盒使用說明書

　　BS-2952大鼠血小板衍生生長因子(PDGF)ELISA試劑盒 天津本生

　　一,、試劑盒原理

　　大鼠血小板衍生生長因子(PDGF)ELISA試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行檢測。該方法基于特異性抗體與PDGF分子的結(jié)合反應(yīng),，通過酶催化底物顯色來定量測定樣本中PDGF的含量?。

　　實(shí)驗(yàn)原理具體為：將抗大鼠PDGF單克隆抗體預(yù)先包被在酶標(biāo)板上，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本后,，其中的PDGF會(huì)與固相抗體結(jié)合。隨后加入生物素化的檢測抗體,，形成"抗體-抗原-抗體"復(fù)合物,。再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素與生物素結(jié)合，最后加入底物TMB顯色,。在HRP催化下,，TMB顯藍(lán)色，加入終止液后變?yōu)辄S色,，顏色的深淺與樣本中PDGF濃度成正比,，通過測定450nm處的吸光度(OD值)即可計(jì)算出PDGF含量?。

　　二,、試劑盒組成

　　本試劑盒通常包含以下主要組分(具體組成可能因不同廠家有所差異)：

　　預(yù)包被酶標(biāo)板?：96孔或48孔,，已包被抗PDGF抗體?

　　PDGF標(biāo)準(zhǔn)品?：凍干粉或溶液形式，濃度通常為2000-2700ng/L,，使用前需用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液重建?

　　樣品稀釋液?：用于稀釋樣本和標(biāo)準(zhǔn)品?

　　生物素化檢測抗體?：特異性識(shí)別PDGF的抗體?

　　酶結(jié)合物?：HRP標(biāo)記的鏈霉親和素?

　　TMB底物溶液?：包含A液和B液,，顯色用?

　　終止液?：通常為硫酸溶液，用于終止反應(yīng)?

　　濃縮洗滌液?：20×或25×濃縮,，使用前需稀釋?

　　封板膜?：防止蒸發(fā)和污染?

　　三,、樣本收集與處理

　　1. 樣本類型

　　本試劑盒適用于檢測大鼠血清、血漿(EDTA,、肝素或檸檬酸鹽抗凝),、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和組織勻漿等樣本中的PDGF含量?。

　　2. 樣本收集

　　血清?：全血室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后,，1000×g離心20分鐘取上清?

　　血漿?：使用抗凝管采集后30分鐘內(nèi),，1000×g離心15分鐘?

　　細(xì)胞上清?：1000×g離心10分鐘去除顆粒?

　　組織勻漿?：加入適量生理鹽水勻漿后，1000×g離心10分鐘取上清?

　　3. 樣本保存

　　樣本在2-8℃可保存48小時(shí),，如需長期保存應(yīng)分裝后于-20℃或-80℃凍存,，避免反復(fù)凍融?。檢測前血清樣本通常需用稀釋液作1:5至10倍稀釋?,。

　　四,、實(shí)驗(yàn)操作步驟

　　1. 試劑準(zhǔn)備

　　標(biāo)準(zhǔn)品配制?：將凍干標(biāo)準(zhǔn)品用1ml蒸餾水或標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液重建，按說明書進(jìn)行系列稀釋(通常設(shè)7-8個(gè)濃度梯度)?

　　洗滌液配制?：將濃縮洗滌液用蒸餾水按1:20稀釋(如1ml濃縮液加19ml水)?

　　抗體工作液配制?：按說明書比例用檢測稀釋液稀釋生物素化抗體和酶結(jié)合物?

　　2. 檢測程序

　　加樣?：每孔加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣本，設(shè)置空白對(duì)照孔?

　　孵育?：37℃溫育30-120分鐘(具體時(shí)間依試劑盒說明)?

　　洗滌?：棄去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液靜置1分鐘后棄去,，重復(fù)4-6次，最后在吸水紙上拍干?

　　加檢測抗體?：每孔加入100μl生物素化抗體工作液,，37℃孵育60分鐘?

　　洗滌?：同步驟3?

　　加酶結(jié)合物?：每孔加入100μl HRP標(biāo)記的鏈霉親和素,，37℃孵育30分鐘?

　　洗滌?：同步驟3?

　　顯色?：每孔加入100μl TMB底物，37℃避光反應(yīng)15分鐘?

　　終止?：每孔加入100μl終止液,，輕輕混勻?

　　讀數(shù)?：30分鐘內(nèi)在酶標(biāo)儀450nm處測定OD值(建議使用630nm作為參考波長)?

　　五,、結(jié)果計(jì)算

　　空白校正?：所有OD值應(yīng)減去空白對(duì)照孔的OD值?

　　繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))，相應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)(線性坐標(biāo)),，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?

　　濃度計(jì)算?：

　　根據(jù)樣品OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的PDGF濃度?

　　若樣本經(jīng)過稀釋,，需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)?

　　也可通過回歸方程計(jì)算濃度：使用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值計(jì)算直線回歸方程，將樣本OD值代入方程求出濃度?

　　六,、注意事項(xiàng)

　　試劑保存?：未使用的試劑應(yīng)嚴(yán)格按說明書要求保存(通常2-8℃),，避免反復(fù)凍融?

　　溫度平衡?：所有試劑和樣本使用前應(yīng)室溫平衡30分鐘?

　　操作規(guī)范?：

　　不同批號(hào)試劑不可混用?

　　加樣時(shí)避免觸碰孔壁和產(chǎn)生氣泡?

　　嚴(yán)格控制各步驟的孵育時(shí)間和溫度?

　　洗滌要充分，防止交叉污染?

　　樣本處理?：

　　避免使用溶血,、高血脂或反復(fù)凍融的樣本?

　　組織樣本應(yīng)充分勻漿?

　　安全防護(hù)?：

　　TMB底物有毒性,，終止液有腐蝕性，應(yīng)避免接觸皮膚?

　　實(shí)驗(yàn)廢棄物應(yīng)按規(guī)定處理?

　　七,、性能參數(shù)

　　靈敏度?：最小檢測濃度通常小于15pg/ml?

　　檢測范圍?：常見為15.625-1000pg/ml或31.2-2000pg/ml?

　　注：以上資料僅供參考,，不作為具體依據(jù)，如果完整產(chǎn)品說明請咨詢技術(shù)老師或品牌供應(yīng)商,。

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