人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)使用說(shuō)明書 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,，追求企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的不斷提升。公司在經(jīng)營(yíng)中始終秉承：遵紀(jì)守法,，嚴(yán)于律己,，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn),，以過(guò)硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來(lái)維護(hù)和拓展市場(chǎng),，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏,，是我們的發(fā)展目標(biāo),，本生，您信任的合作伙伴,！本生試劑盒

　　人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)ELISA試劑盒的實(shí)驗(yàn)使用說(shuō)明書如下：

　　一,、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

　　本試劑盒用于檢測(cè)人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)水平,。

　　二,、實(shí)驗(yàn)原理

　　本試劑盒采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定標(biāo)本中人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)。用純化的抗原包被微孔板,，制成固相抗原,，可與樣品中抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP標(biāo)記的抗原結(jié)合,，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物,。經(jīng)過(guò)洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中pANCA的含量呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，與CUTOFF值相比較,，從而判定標(biāo)本中人抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)的存在與否,。

　　三、樣本處理

　　?血清?：室溫血液自然凝固10~20分鐘,，離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分),。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。

　　?血漿?：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10~20分鐘后,，離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分),。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心,。

　　?尿液?：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分),。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實(shí)行。

　　?細(xì)胞培養(yǎng)上清?：檢測(cè)分泌性的成份時(shí),，用無(wú)菌管收集,。離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用PBS(PH7.2~7.4)稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右,。通過(guò)反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分),。仔細(xì)收集上清,。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。

　　?組織標(biāo)本?：切割標(biāo)本后,，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2~8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,。離心20分鐘左右(2000~3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,。分裝后一份待檢測(cè),，其余冷凍備用。

　　四,、實(shí)驗(yàn)步驟

　　?編號(hào)?：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽(yáng)性對(duì)照2孔,、空白對(duì)照1孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同)。

　　?加樣?：分別在陰,、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照,、陽(yáng)性對(duì)照50μl,。然后在待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測(cè)樣品10μl。

　　?溫育?：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。

　　?配液?：將30倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用,。

　　?洗滌?：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次,，拍干。

　　?加酶?：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外,。

　　?溫育?：操作同3。

　　?洗滌?：操作同5,。

　　?顯色?：每孔先加入顯色劑A 50μl,，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘,。

　　?終止?：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

　　?測(cè)定?：以空白空調(diào)零,，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值),。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

　　五,、結(jié)果判定

　　?試驗(yàn)有效性?：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00;陰性對(duì)照平均值≤0.10,。

　　?臨界值(CUT OFF)計(jì)算?：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15。

　　?陰性判定?：樣品OD值<臨界值(CUT OFF)者為抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)陰性,。

　　?陽(yáng)性判定?：樣品OD值≥臨界值(CUT OFF)者為抗中性粒細(xì)胞核周抗體(pANCA)陽(yáng)性,。

　　六、注意事項(xiàng)

　　操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行,，本試劑不同批號(hào)組分不得混用,。

　　試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15~30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。

　　濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,，洗滌時(shí)不影響結(jié)果,。封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。

　　底物請(qǐng)避光保存,。

　　試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí),，參考波長(zhǎng)為630nm,。

　　所有樣品、洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。終止液為2M的硫酸,，使用時(shí)必須注意安全。

　　七,、保存條件與有效期

　　?保存條件?：2~8℃低溫冷藏,。

　　?有效期?：6個(gè)月。

　　請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,。