問題解析：熒光定量PCR反應結(jié)束無擴增曲線

　　熒光定量 PCR反應結(jié)束無擴增曲線出現(xiàn)這個問題的常見原因,，主要可以歸結(jié)為以下幾種：

　　反應循環(huán)數(shù)不夠：一般建議設置循環(huán)數(shù)為 40,。

　　程序中未設置信號采集步驟：注意,，兩步法擴增程序一般將信號采集設置在退火延伸階段;三步法擴增程序應當將信號采集設置在 72 度延伸階段,。

　　引物降解：長時間未使用的引物應先通過 PAGE 電泳檢測完整性,，以排除引物降解的可能性,。

　　模板濃度太低：這個大家減少稀釋度重復實驗就可以了,，一般來說,，未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

　　模板降解：無解,，請重新制備模板,，可以重復實驗。

　　溶解曲線形狀異常

　　(1)雜峰在主峰之前,，Tm 約為 70 - 75℃——一般為引物二聚體

　　這種情況主要有三個解決方法：

　　重新設計引物;

　　雜峰為引物二聚體,，熒光定量 PCR引物二聚體主要是由于體系內(nèi)引物與引物糾纏比引物與模板結(jié)合更容易導致的，可以嘗試提高模板濃度,、退火溫度或者降低引物濃度來進行改善;

　　另外,，當目的基因表達量極低時，染料法容易形成引物二聚體產(chǎn)物影響實驗結(jié)果,，此時,，建議使用探針法定量。

　　(2)雜峰在主峰之后,，非引物二聚體

　　上圖這種情況就是非特異性擴增,，可能是引物特異性不好引起的，也可能是空氣中有氣溶膠污染所導致,。

　　大家可以先增加退火溫度再試試看,，如果沒有改善，那么就需要重新更換引物啦,。

　　為了避免這種麻煩,，BUNSEN本生小編建議大家在進行熒光定量 PCR實驗之前，就對自己的引物做一個特異性驗證,。另外,，每次試驗的 NTC(no template control)是一定要做的。

　　(3)只有引物二聚體,，無目的條帶

　　如果擴增片段過短(小于 80bp),，那么僅通過融解曲線就很難區(qū)分引物二聚/目的條帶,。

　　另外，也有可能是 熒光定量 PCR 擴增效率低或者沒有擴增,，體系里邊只有引物糾纏成的二聚體了,。

　　總之，產(chǎn)物長度建議大家還是設置在 100 - 200 bp,，不要太短了,。

　　注：以上資料僅供參考!

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