ELISA實驗結果不理想、應注意哪些要點

　　優(yōu)化ELISA的重點之一在于洗滌,。洗滌步驟可降低未結合抗體所引起的背景信號,，從而增加分析的信噪比,。每一步之間的洗滌確保只有特異的結合事件被保留，在最后一步產生信號,。而不充分的洗滌會導致差異和高背景,，從而帶來不理想的結果。

　　在做ELISA實驗時,，洗板有兩種方法：手工法洗板 和 洗板機洗板,。二者沒有本質的差別，只要操作合乎要求,，均能得到正確,、可靠的結果。

　　手工洗板：

　　手工洗板人為因素比較大,，實驗人員必須經驗豐富,，洗滌次數要足夠，沖擊力又不要太大,，加入的洗液量以說明書為準,，防止孔口內有游離酶未能洗凈，同時防止孔與孔之間液體交叉,。洗滌結束后扣干亦非常重要,，否則易造成假陽性。每次洗完板后,，在吸水紙上輕輕拍干，拍板時要垂直,，避免交叉感染,。用力不能過猛，防止抗原抗體復合物脫離;吸水紙要一次性使用,，應使用不易脫落碎屑的吸水紙為宜,。酶結合物不耐干燥，特別在較高的溫度下更易失活,，所以拍干的反應板應盡量縮短在空氣中暴露的時間,，時間越長，吸光度值越低,。

　　手工操作有 浸泡式 和 流水沖洗式 兩種方法：

　　浸泡式

　　1. 吸干或甩干孔內反應液;

　　2. 用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后,，即甩去);

　　3. 浸泡，即將洗滌液注滿板孔,，放置1～2分鐘,，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短;

　　4. 吸干孔內液體,。吸干應,，可用水泵或真空泵抽吸,，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干;

　　5. 重復操作步驟3和4，洗滌3～4次(或按說明規(guī)定),。在間接法中如本底較高,，可增加洗滌次數或延長浸泡時間。

　　微量滴定板多采用浸泡式洗滌法,。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團,，也含親水基團,，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合,，并借助于親水基團和水分子的結合作用,，使蛋白質回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體,。

　　洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,，其濃度可在0.05%～0.2%之間，高于0.2%時,，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度,。

　　流水沖洗式

　　流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水,。洗滌時附接一特殊裝置,，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續(xù)沖洗2分鐘后,，吸干液體,，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可,。浸泡式猶如盆浴,，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為,，且也簡便,、快速。

　　已有實驗表明,，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌,。洗滌時設法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面,，洗滌效果更佳,。

　　洗板機洗板：

　　洗板機洗板人為因素少，速度快,，條件恒定,，但是使用洗板機洗板時應注意以下三個關鍵點,。

　　洗滌參數

　　主要的參數是洗滌量。自動洗板機會分配洗滌液,。如果你之前遭遇過高背景,，那么不要猶豫，將洗滌量調為高,，最好是比包被體積更高,。太少的洗滌液會讓一部分分析表面洗滌不到，從而明顯增加背景,。所有反應孔的洗滌量必須相同,。

　　ELISA試劑盒的使用手冊中有列出洗滌量。我們建議使用350µl洗滌液進行洗滌,，以便清潔整個反應孔的壁,。一般來說，洗滌量越高,，則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少,。

　　洗滌次數

　　影響洗滌效果的主要參數是洗滌循環(huán)的量。當然,，洗滌次數越多,，背景越低。然而,，太多次的洗滌會降低信號強度,，使其難以測定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復洗滌三次,。不過,，一般而言，包被平板需要的洗滌次數比用戶包被的平板要少,。對于用戶包被的ELISA板，必須優(yōu)化洗滌次數,。

　　控制洗滌量和洗滌次數的另一種方法是加入過量的洗滌液,。一般來說，96孔板的每個孔能容納330至460 µl,。不過,，有些自動化洗板機可設置程序，分配遠遠超出這個量的洗滌液,，比如1 ml,。它是如何做到的呢?其實很簡單，就是在分液的同時打開吸液功能,。換句話說,，隨著分液器分配更多的液體,，抽吸器也將液體吸出。這種技術能增加洗滌量,，但不會溢出到其他孔中,。

　　抽 吸

　　還有一些參數會影響洗滌步驟的效果。這些參數包括吸液高度和吸入位置,，這兩者都能調整,，以降低背景(殘留量)和差異。

　　殘留液體中包含未結合的抗原或抗體,，它們會增加背景信號,。殘留量越小，殘留液體越少,，轉移到下一步的干擾液體也就越少,。

　　吸液高度會明顯影響殘留量;如果洗滌吸頭與反應孔底部的距離稍大，那就會讓殘留量急劇增加,。反之,，如果洗滌吸頭壓著反應孔底部，那么也會使吸液效率降低,，殘留量增加,。

　　目前的洗板機一般使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動。浮動洗頭中的吸頭可在洗滌過程中自由上下移動,，而剛性洗頭則固定在適當的位置,。使用剛性洗頭的洗滌操作在優(yōu)化起來更為復雜，因為你需要非常仔細地調整吸液高度,。如果你們實驗室使用幾種不同的板,，那可能會很耗時。在使用浮動洗頭時,，吸頭會降到反應孔的底部,。調整高度就不是很重要，因此洗頭會下降到底部,。

　　抽吸的位置也對殘留量有著重要影響;如果每個孔只使用一個抽吸點(這很常見,，因為更快)，那么抽吸的位置需要優(yōu)化,。最佳的位置取決于洗頭的性狀,，但它幾乎不在反應孔的中間，即使這是所有洗頭最常見的默認位置,。一般來說,，最佳位置在孔中間與孔壁之間的某處。

　　反應孔的形狀也會影響殘留量,。C形底(平底圓角)的微孔板一般會比那些平底尖角的微孔板殘留量更低,。

　　洗板時注意事項：

　　1. 需每天校正注液量及殘液量,，洗滌后殘液量不得大于2 μl。

　　2. 及時更換破損吸液針,，避免破壞底板包被,。

　　3. 針對不同廠家酶標板注意調整吸液頭下降高度，避免沖洗針頭卡住酶標板,。

　　4. 注意調整洗液量,，洗液量過多將溢出，過少將達不到洗滌效果,。

　　5. 關機前使用蒸餾水沖洗管道,，避免洗液的結晶物堵塞管道。

　　4. 不同種試劑盒的洗液嚴禁混合使用,。

　　為了洗滌效果較好,，實驗室可采用機器與人工洗滌相結合的方法，在機器洗滌后再進行人工洗板1～2次,，能達到理想的洗滌效果,。ELISA看起來很簡單，但是在實際操作過程中,，絕不能掉以輕心,，除了嚴謹規(guī)范的實驗操作，高品質的試劑盒與專業(yè)的技術團隊也是獲得準確結果的保證!

　　ELISA 本生一直視質量控制為企業(yè)的生命,，追求企業(yè)競爭力的不斷提升,。公司在經營中始終秉承：遵紀守法，嚴于律己,，寬仁以待,，敢于承擔的企業(yè)精神作為標準，以過硬的質量和優(yōu)良的服務來維護和拓展市場,，較大限度的滿足客戶的需求,。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標,。本生!您信任的合作伙伴,。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來,。