BUNSEN本生：ELISA試劑操作常見問題及解決方案

　　一,、為什么所有試劑和檢測樣本要平衡至室溫后再進行加樣操作

　　溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素,。為了使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng),，實驗前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫,，包括檢測樣本,。避免因溫度的動力學(xué)反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA試劑盒檢測結(jié)果的不準確,。

　　二,、如何獲得良好線性的標準曲線

　　按照推薦方式保存標準品;溶解標準品之前需短暫離心，che底收集粉末;確保標準品wan全溶解和混勻(大約10min),，然后再進行后續(xù)的系列稀釋步驟,，確保每一步都充分混勻且移液;顯色的恰當(dāng)終止;選擇合適的數(shù)學(xué)擬合方程繪制標準曲線,。

　　三、ELISA實驗為什么必須設(shè)置復(fù)孔

　　為獲得準確的實驗結(jié)果,，強烈建議標準品及樣本進行復(fù)孔檢測,。因為復(fù)孔檢測可以：計算平均值，確保實驗結(jié)果準確;解決實驗中誤操作造成的跳孔現(xiàn)象;計算CV值,，對實驗的操作和試劑盒的度進行評估,。

　　四、為什么實驗過程中孵育,、洗滌需要振蕩,，如何振蕩

　　振蕩孵育使反應(yīng)充分，振蕩洗滌使背景干凈,。建議使用酶標專用96孔微孔板振蕩器,。孵育過程振蕩，可以加快,、加強抗原抗體分子間的相互碰撞接觸,，使得反應(yīng)過程加wan全，OD值通常會比未振蕩孵育的結(jié)果要高;洗滌過程振蕩,，可以使洗板干凈,，在很大程度上能降低背景值，同時可以提高試劑盒檢測的靈敏度,。

　　五,、何時終止ELISA反應(yīng)

　　ELISA實驗終需要酶催化底物顯色反應(yīng)來完成，在佳時間終止反應(yīng)是ELISA試劑盒實驗成功的重要因素,。在HRP-TMB酶促反應(yīng)系統(tǒng)中，S5出現(xiàn)淡藍色,，S1–S3有明顯的階梯型藍色,，便需要終止反應(yīng)。

　　六,、為什么酶標儀讀數(shù)時必須選用雙波長

　　首先,，酶標儀使用前務(wù)必預(yù)熱10-15min，使測讀結(jié)果穩(wěn)定,。其次,，ELISA實驗采用雙波長測定吸光度，可以排除單波長檢測時的測定干擾(標本的濃度,，干擾色等),。一般采用大波長作為參照波長，在參照波長下,，檢測物的吸光值小,，檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收;因此,，雙波長測定可大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對酶標儀讀數(shù)帶來的誤差,，以保證實驗數(shù)據(jù)的準確度,。

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