多色免疫熒光染色試劑盒使用說明

　　酪酰胺信號放大(TSA,，Tyramide signal amplification)技術是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法，類似常規(guī)免疫組化的DAB顯色方法 ，TSA技術同樣采用HRP標記的二抗,，同樣有對應的“顯色"步驟(HRP催化加入反應體系的酪胺熒光素底物,，產生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨酸等殘基共價結合,，使樣品上穩(wěn)定的共價結合酪胺熒光素,。之后用熱修復法洗去非共價結合的一抗-二抗-HRP復合物，重復下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵育,，換另一種酪胺熒光素底物,，如此往復就可實現多重標記。

　　TSA詳細原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結合位點),，產生大量的酶促產物,，該產物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結合,，這樣在抗原-抗體結合部位就有大量的熒光素沉積,，結果使其檢測信號得到10-100倍增強。簡單來說,，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP(而不是直接偶聯熒光素)，來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素,。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化,，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結合,。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理,，前一輪非共價結合的抗體被洗掉，共價結合的熒光素穩(wěn)定共價結合在樣本切片蛋白上,。再換個一抗來第二輪孵育,，周而復始。等到所有抗體孵育結束,，熒光素都結合好后,，最后去檢測結果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育,，因此無需擔心抗體交叉反應,，以及一抗二抗種屬匹配問題，大大減少了實驗設計時不同種屬抗體選擇匹配的限制,。也就是說,，如果用TSA技術，同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體,。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進行實驗,，而且信號放大的倍數大大增強。茹創(chuàng)生物開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種：TYR-480,，TYR-520,，TYR-570,，TYR-620，TYR-690,，TYR-780,。此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用?？梢詫崿F單標,、雙標、三標以及更多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能,，極大豐富了此試劑盒的內涵,。

　　試劑盒組成：

　　產品名稱規(guī)格保 存?zhèn)渥?/p>

　　TYR-520熒光染料(綠光)(即用型)5mL-20℃TYR-520熒光染料 、TYR-570熒光染料 ,、TYR-690熒光染料 在-20度下 ,，均為固體，使用之前需解凍,。

　　TYR-570熒光染料(紅光)(即用型)5mL-20℃

　　TYR-690熒光染料(即用型)5mL-20℃

　　TSA+增強劑100ul-20℃(可選)

　　高敏多聚hrp山羊抗兔二抗5mL4℃

　　TSA+增強劑使用方法：TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號5-10倍,，TSA+增強劑：TYR熒光放大液=1:500，使用TSA+增強劑不是必須的選項,，可以根據具體的情況選擇添加或者不選擇添加,。

　　操作流程：

　　1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲benⅠ15min-二甲benⅡ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ,。取出放在通風廚內,，酒精晾干后放入自來水中稍洗，蒸餾水洗,。

　　2,、 抗原修復：組織切片置于盛滿PH 9.0 EDTA堿性抗原修復液或者PH6.0檸檬酸修復緩沖液的修復盒中于微波爐內進行抗原修復(也可以用高壓1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他熱修復方法)。中火8min,，?；?min，轉中低火7min,，此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。(修復液和修復條件根據組織類型以及抗原類型來確定)。

　　3,、 阻斷內源性過氧化物酶：切片放入3%過氧化氫溶液,，室溫避光孵育15 min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。

　　4,、 BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，在圈內滴加用3%BSA-PBS(或者其他封閉液)均勻覆蓋組織,，室溫封閉30min,。

　　5、 加一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X,，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜或者37度1-2h。(濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā))

　　6,、 加hrp二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的hrp二抗覆蓋組織,，避光室溫孵育50min,，PBS洗三次。

　　7,、 熒光染料反應：TYRXXX熒光染料反應10-15min,，PBS洗三次。

　　8,、 重復2-7步驟(換用另外一種TYRXXX熒光染料)

　　9,、 DAPI復染細胞核：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min,。

　　10,、 封片：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,。

　　11、 鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像,。

　　染料激發(fā)波長發(fā)射波長

　　DAPI 藍色350420

　　TYR-480450480

　　TYR-520綠色490520

　　TYR-570紅色550570

　　TYR-620590620

　　TYR-690630690

　　TYR-780750780

　　文章引用試劑盒/方法：Co-staining of A, B and C was performed using a Four-color Fluorescence kit (Guduo Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.