ELISA各個操作步驟的注意要點,，珠式,、管式及磁性球ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用,，兩者均有詳細的使用說明,，嚴格遵照規(guī)定操作，必能得出準確的結(jié)果,。

　　一,、標本的采取和保存

　　可用作ELISA測定的標本十分廣泛，體液(如血清),、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液,、糞便)等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進行測定(如血清,、尿液),，有些則需經(jīng)預(yù)處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA檢測均以血清為標本,。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,，其他成份均同等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑,，而血清標本只要待血清自然凝固、收縮后即可取得。除特殊情況外,，在醫(yī)學(xué)檢驗中均以血清作為檢測標本,。在ELISA中血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標本可按常規(guī)方法采集,，應(yīng)注意避免溶血,，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標記的ELISA測定中,，溶血標本可能會增加非特異性顯色,。

　　血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久,，其中的可發(fā)生聚合,，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來,，在5天內(nèi)測定的血清標本可放置于4℃,，超過一周測定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后,，蛋白質(zhì)局部濃縮,，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩,，避免氣泡,，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩,?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫?yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測,。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落,，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存,。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作,，也可加入適當防腐劑。

　　二,、試劑的準備

　　按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑,。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的,，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的,。自配的緩沖液應(yīng)用pH計測量較正,。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存,。

　　三,、加樣

　　在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本,，加酶結(jié)合物,，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡,。加標本一般用微量加樣器,，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應(yīng)更換吸嘴,，以免發(fā)生交叉污染,，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定(如間接法ELISA)需用稀釋的血清,，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣,。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本,，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以混和,。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成,。

　　四,、保溫

　　在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標本和加酶結(jié)合物后,?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation),，有人稱之為孵育,，在ELISA中似不恰當。

　　ELISA屬固相免疫測定,，抗原,、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例,，加入板孔中的標本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,。這是一個逐步平衡的過程,，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點,。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育,。

　　溫育常采用的溫度有43℃,、37℃,、室溫和4℃(冰箱溫度)等,。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度,。在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時,，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時,，產(chǎn)物的生成可達,。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度,，有些試驗在43℃進行,，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4℃更為,，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜，以形成多的沉淀,。但因所需時間太長,，在ELISA中一般不予采用。

　　保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外,，一般均采用水浴,，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面,，使溫度迅速平衡,。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋,，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱,，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi),，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布,，將ELISA板放在濕紗布上,。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此,。無論是水浴還是濕盒溫育,，反應(yīng)板均不宜疊放,，以各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng),，操作時的室溫應(yīng)嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi),，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育,。室溫溫育時,，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確,。為這一點,，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定,。