細胞培養(yǎng)的步驟及注意事項!

　　一、 復蘇

　　1. 把凍存管從液氮中取出來,，立即投入37℃水浴鍋中,，輕微搖動,。液體都融化后(大概1-1.5分鐘),，拿出來噴點酒精放到超凈工作臺里,。

　　2. 把上述細胞懸液吸到裝10ml培養(yǎng)基的15ml的離心管中(用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細胞都洗下來),，1000轉離心5分鐘,。

　　3. 把上清液倒掉，加1ml培養(yǎng)基把細胞懸浮起來,。吸到裝有10ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中后左右輕輕搖動,，使培養(yǎng)皿中的細胞均勻分布。

　　4. 標好細胞種類和日期,、培養(yǎng)人名字等,，放到CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，細胞貼壁后換培養(yǎng)基。

　　5. 3天換一次培養(yǎng)基,。

　　二、 傳代

　　1. 培養(yǎng)皿中的細胞覆蓋率達到80%-90%時要傳代,。

　　2. 把原有培養(yǎng)基吸掉,。

　　3. 加適當?shù)囊鹊鞍酌?能覆蓋細胞就行)，消化1-2分鐘,。

　　4. 細胞都變圓后加如入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化,。

　　5. 用移液槍吹打細胞，把細胞都懸浮起來,。

　　6. 把細胞吸到15ml的離心管中,，1000轉離心5分鐘。

　　7. 倒掉上清液,，加1-2ml培養(yǎng)基,，把細胞都吹起來。

　　8. 根據(jù)細胞種類把細胞傳到幾個培養(yǎng)皿中,。一般,，癌細胞分5個，正常細胞傳3個,。繼續(xù)培養(yǎng),。

　　三、 凍存把細胞消化下來并離心(同上),。用配好的凍存液把細胞懸浮起來,，分裝到滅菌的凍存管中，靜止幾分鐘,，寫明細胞種類,，凍存日期。4℃  30min,，-20℃ 30min,，-80℃過夜，然后放到液氮灌中保存,。 凍存液的配制： 70%的培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.  DMSO要慢慢滴加,，邊滴邊搖。

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