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天津本生—PCR技術(shù)原理,、實驗步驟和應用

時間:2020/12/16閱讀:1741
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  天津本生—PCR技術(shù)原理,、實驗步驟和應用

  實驗目的

  1.掌握聚合酶鏈式反應的原理,。

  2.掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。

  二,、實驗原理

  PCR技術(shù),,即聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)是由美PECetus公司的KaryMullis在1983年(1993年獲諾貝爾化學獎)建立的,。這項技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時反應就將特定的DNA的片段擴增數(shù)百萬倍,,這種迅速獲取大量單核酸片段的技術(shù)在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義,大地推動了生命科學的研究進展,。它不僅是DNA分析常用的技術(shù),而且在DNA重組與表達,、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應用價值,。

  PCR可以被認為是與發(fā)生在細胞內(nèi)的DNA復制過程相似的技術(shù),其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補DNA的片段,。細胞中DNA的復制是個非常復雜的過程,。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應,,基本原理與細胞內(nèi)DNA復制相似,,但反應體系相對較簡單。

  PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構(gòu)成:

 ?、倌0錎NA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右定時間后,,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,,以便它與引物結(jié)合,,為下輪反應做準備;

  ②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,,溫度降至55℃左右,,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;

  ③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下,,以dNTP為反應原料,,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,,合成條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈,。

  重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成個循環(huán)需2~4分鐘,,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

  三,、實驗試劑與器材

  模板DNA,、2.5mmol/LdNTP

  TaqDNA聚合酶(5U/μL)、SSR引物

  10×buffer,、15mmol/LMg2+,、ddH2O

  PCR儀、移液槍,、PCR板

  四,、實驗步驟

  1、配制20μL反應體系,,在PCR板中依次加入下列溶液:

  模板DNA2μL

  引物11μL

  引物21μL

  dNTP1.5μL

  MgCl22μL

  10×buffer2μL

  ddH2O10μL

  Taq酶0.5μL

  2,、設(shè)置PCR反應程序。

  3,、上樣,,啟動反應程序。

  4,、擴增產(chǎn)物的電泳檢測,。

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