天津本生—PCR技術(shù)原理,、實驗步驟和應(yīng)用

　　實驗?zāi)康?/span>

　　1.掌握聚合酶鏈式反應(yīng)的原理,。

　　2.掌握移液槍和PCR儀的基本操作技術(shù)。

　　二,、實驗原理

　　PCR技術(shù),，即聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)是由美PECetus公司的KaryMullis在1983年(1993年獲諾貝爾化學(xué)獎)建立的,。這項技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時反應(yīng)就將特定的DNA的片段擴增數(shù)百萬倍,，這種迅速獲取大量單核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義,，大地推動了生命科學(xué)的研究進展,。它不僅是DNA分析常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達,、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應(yīng)用價值,。

　　PCR可以被認為是與發(fā)生在細胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補DNA的片段,。細胞中DNA的復(fù)制是個非常復(fù)雜的過程,。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復(fù)制反應(yīng),，基本原理與細胞內(nèi)DNA復(fù)制相似,，但反應(yīng)體系相對較簡單。

　　PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

　?、倌０錎NA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右定時間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合,，為下輪反應(yīng)做準備;

　?、谀０錎NA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;

　?、垡锏难由欤篋NA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料,，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈,。

　　重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成個循環(huán)需2～4分鐘,，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

　　三,、實驗試劑與器材

　　模板DNA,、2.5mmol/LdNTP

　　TaqDNA聚合酶(5U/μL)、SSR引物

　　10×buffer,、15mmol/LMg2+,、ddH2O

　　PCR儀、移液槍,、PCR板

　　四,、實驗步驟

　　1、配制20μL反應(yīng)體系,，在PCR板中依次加入下列溶液：

　　模板DNA2μL

　　引物11μL

　　引物21μL

　　dNTP1.5μL

　　MgCl22μL

　　10×buffer2μL

　　ddH2O10μL

　　Taq酶0.5μL

　　2,、設(shè)置PCR反應(yīng)程序。

　　3,、上樣,，啟動反應(yīng)程序。

　　4,、擴增產(chǎn)物的電泳檢測,。

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