ELISA各個(gè)操作步驟的注意要點(diǎn),，珠式、管式及磁性球ELSIA,，國(guó)外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用,，兩者均有詳細(xì)的使用說(shuō)明，嚴(yán)格遵照規(guī)定操作,，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果,。

一、標(biāo)本的采取和保存

可用作ELISA測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛,，體液(如血清),、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液,、糞便)等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測(cè)定(如血清,、尿液),，有些則需經(jīng)預(yù)處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA檢測(cè)均以血清為標(biāo)本,。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,，其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑,，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固,、即可取得。除特殊情況外,，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測(cè)標(biāo)本,。在ELISA中血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集,，應(yīng)注意避免溶血,，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì),，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中,，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。

血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè),。如有細(xì)菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng),。如在冰箱中保存過(guò)久,，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深,。一般說(shuō)來(lái),，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過(guò)一周測(cè)定的需低溫冰存,。凍結(jié)血清融解后,，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均,，應(yīng)充分混勻宜輕緩,，避免氣泡，可上下顛倒混和,，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩,。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾,，澄清后再檢測(cè),。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落,，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存,。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無(wú)菌操作,，也可加入適當(dāng)防腐劑。

二,、試劑的準(zhǔn)備

按試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑,。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的,，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的,。自配的緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測(cè)量較正。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用,。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存,。

三、加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚,，即加標(biāo)本,，加酶結(jié)合物，加底物,。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡,。加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中,。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴,，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣,。有此測(cè)定(如間接法ELISA)需用稀釋的血清,，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液,，再在其中加入血清標(biāo)本,，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器,，使加液過(guò)程迅速完成,。

四、保溫

在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng),，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后,。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間,，這一保溫過(guò)程稱為溫育(incubation),，有人稱之為孵育,，在ELISA中似不恰當(dāng)。

ELISA屬固相免疫測(cè)定,，抗原,、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例,，加入板孔中的標(biāo)本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程,，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此,。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育,。

溫育常采用的溫度有43℃、37℃,、室溫和4℃(冰箱溫度)等,。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度,。在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí),，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí),，產(chǎn)物的生成可達(dá),。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度,，有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度,?？乖贵w反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測(cè)定中多使反應(yīng)在冰箱中過(guò)夜,，以形成多的沉淀,。但因所需時(shí)間太長(zhǎng)，在ELISA中一般不予采用,。

保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外,，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中,，ELISA板底應(yīng)貼著水面,，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋,，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱,，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi),，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布,，后將ELISA板放在濕紗布上,。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此,。無(wú)論是水浴還是濕盒溫育,，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。室溫溫育的反應(yīng),，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃,，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育,。室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可,。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確,。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí),，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定,。