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　　熒光定量PCR實驗步驟：

　　①取凍存已裂解的細胞,，室溫放置5分鐘使其*溶解,。

　　②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang,，蓋緊管蓋,。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘,。4℃下12000rpm離心15分鐘,。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無色水相上層,。RNA全部被分配于水相中,。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

　?、跼NA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中,。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后,，于4℃下12000rpm 離心10分鐘,。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

　?、躌NA清洗 移去上清液,，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),，清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。

　?、軷NA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘,。

　?、奕芙釸NA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次,，使其*溶解,，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定

　　先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零,。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度,。

　?、?濃度測定

　　A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml,。具體計算如下：

　　RNA溶于40 μl DEPC水中,，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中,，測得A260 = 0.21

　　RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

　　取5ul用來測量以后,，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為：

　　35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

　?、诩兌葯z測

　　RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,，比值范圍1.8到2.1。

　　2)變性瓊脂糖凝膠電泳測定

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　　1g瓊脂糖溶于72ml水中,，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M),。

　　灌制凝膠板,，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子,，將凝膠板放入電泳槽內(nèi),，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

　?、跍蕚銻NA樣品

　　取3μgRNA,，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性,。

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　　上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔,。5–6V/cm電壓下2h,，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。

　?、茏贤馔干涔庀掠^察并拍照

　　28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型),，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶,，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成,。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成,。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染,，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶,，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散,。用數(shù)碼照相機拍下電泳結(jié)果。 ①反應體系 序號 反應物 劑量 1 逆轉(zhuǎn)錄buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dNTP 0.1μl 5 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5μl 6 DEPC水 5μl 7 RNA模版 2μl 8 總體積 10μl 輕彈管底將溶液混合,，6000rpm短暫離心,。

　　②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘,，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致,，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘,。

　?、廴〕龊罅⒓?5℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液,，保存于-80℃待用,。 管家基因(β-actin)實時定量PCR

　　①β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011,，反應前取3μl按10倍稀釋(加水27μl并充分混勻)為1010,，依次稀釋至109、108,、107,、106、105,、104,，以備用,。

　　②反應體系如下：

　　標準品反應體系 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 陽性模板上游引物F 0.5μl 3 陽性模板下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 陽性模板DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合,，6000rpm短暫離心,。

　　管家基因反應體系： 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 內(nèi)參照上游引物F 0.5μl 3 內(nèi)參照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待測樣品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心,。

　?、壑苽浜玫年栃詷藴势泛蜋z測樣本同時上機，反應條件為：93℃2分鐘,，然后93℃ 1分鐘,，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán),。 ①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應,。

　　反應體系： 序號 反應物 劑量 1 10×PCR緩沖液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至總體積為 25ul 輕彈管底將溶液混合,，6000rpm短暫離心。

　　35個PCR循環(huán)(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72℃延伸5分鐘,。

　?、赑CR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色,，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶,。

　　③將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010,，依次稀釋至109,、108、107,、106,、105、104幾個濃度梯度,。 ①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系,。

　　體系配置如下： 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1ul 3 下游引物 1ul 4 dNTP 1ul 5 Taq聚合酶 2ul 6 待測樣品cDNA 5ul 7 ddH2O 30ul 8 總體積 50 ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心,。

　?、趯⑴渲坪玫腜CR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃2分鐘預變性,，然后按93℃ 1分鐘,，55℃1分鐘，72℃1分鐘,，共40做個循環(huán),，后72℃7分鐘延伸,。 各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,，GoldView染色,，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。

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