奧林巴斯熒光顯微鏡的解剖圖

2018/7/26 7:52:45 發(fā)布者：admin

與基于宏觀樣本特征的其他光學(xué)顯微鏡模式相比，例如相位梯度,，光吸收和雙折射,，熒光顯微鏡能夠僅基于熒光發(fā)射的特性來(lái)成像單個(gè)分子種類的分布。因此,，使用熒光顯微鏡,，可以監(jiān)測(cè)用特定熒光團(tuán)標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)組分的精確位置，以及它們相關(guān)的擴(kuò)散系數(shù),，轉(zhuǎn)運(yùn)特征和與其他生物分子的相互作用。此外,，熒光對(duì)局部環(huán)境變量的顯著響應(yīng)使得能夠研究活細(xì)胞和組織中的pH,，粘度，折射率,，離子濃度,，膜電位和溶劑極性。

早的熒光顯微鏡配置采用經(jīng)典的明場(chǎng)或暗場(chǎng)透射（透射光）光學(xué)系統(tǒng)，將通過(guò)濾光器的激發(fā)光聚焦到樣品平面上,。通過(guò)物鏡收集熒光發(fā)射以及大量的激發(fā)照射,，并通過(guò)第二濾光器投射到目鏡光闌中以形成中間圖像。因?yàn)榧ぐl(fā)光的強(qiáng)度通常比熒光發(fā)射大幾個(gè)數(shù)量級(jí),，所以這些早期透射光顯微鏡中的樣本視圖通常對(duì)比度非常低并且疊加在充滿散射激發(fā)照射的背景上,。使用高數(shù)值孔徑油浸暗場(chǎng)聚光器以高傾斜方位角照射樣品有助于消除大部分背景噪聲，但除了低數(shù)值孔徑物鏡外,，沒(méi)有提供足夠的照明,。產(chǎn)生的圖像分辨率差，亮度非常低,。

熒光顯微鏡與入射光（反射光或落射）照明初是在20世紀(jì)20年代后期開發(fā)的,，用于觀察不透明冶金樣品中的熒光發(fā)射。與他們的明場(chǎng)對(duì)應(yīng)物一樣,，這些反射光熒光儀器采用半反射式分束器,，其總效率約為25％（每次通過(guò)鏡子后失去50％的照度）。然而,，反射光熒光顯微鏡享有具有作為聚光器的高數(shù)值孔徑物鏡的優(yōu)點(diǎn),，并且能夠產(chǎn)生比在相似數(shù)值孔徑下操作的透射光顯微鏡具有顯著更高水平的圖像。此外,，反射回物鏡（在高數(shù)值孔徑下）的雜散激發(fā)光減少到僅百分之幾,。物鏡在反射光顯微鏡中的雙重作用也顯著簡(jiǎn)化了對(duì)準(zhǔn)任務(wù)。僅將物鏡聚焦到樣品上建立了照明場(chǎng)和視場(chǎng),，使得入射的激發(fā)光和觀察到的熒光發(fā)射遵循通過(guò)顯微鏡光學(xué)系列的相同路徑,。

當(dāng)在20世紀(jì)30年代中期開發(fā)出緊湊型汞蒸氣和氙弧放電燈時(shí)，照明光源的技術(shù)進(jìn)步推動(dòng)了反射光熒光（至少對(duì)于金相學(xué)）的轉(zhuǎn)變,。在此期間,，有色玻璃和明膠過(guò)濾器也變得更加復(fù)雜，這使得能夠使用鹵鎢燈應(yīng)用由藍(lán)色和綠色可見(jiàn)光激發(fā)的熒光染料,?？狗瓷渫繉雍透倪M(jìn)的玻璃配方在20世紀(jì)40年代導(dǎo)致了物鏡設(shè)計(jì)的重大改進(jìn)，但對(duì)入射光熒光顯微鏡發(fā)展的根本貢獻(xiàn)是引入了二色分光鏡（也稱為二向色鏡））由俄羅斯光學(xué)科學(xué)家Eugeny Brumberg于1948年開始,。這項(xiàng)創(chuàng)新克服了在反射光顯微鏡中使用普通半反射鏡所固有的光損失問(wèn)題,。反射光熒光顯微鏡初由Johan S. Ploem在20世紀(jì)60年代后期廣泛商業(yè)化，他在開發(fā)Wild-Leitz Ploem Opak方面發(fā)揮了重要作用,，其中包含多個(gè)可互換的光學(xué)模塊,，并裝有各種熒光顯微鏡過(guò)濾器組合。

落射熒光顯微鏡的基本策略

反射光熒光顯微鏡絕大多數(shù)是用于非相干光源的寬場(chǎng)研究的當(dāng)前選擇方法,，以及用激光掃描共聚焦和多光子儀器進(jìn)行的那些,。這種流行的熒光顯微鏡模式也稱為入射光熒光,，反射熒光或簡(jiǎn)單的落射熒光。典型的現(xiàn)代反射光熒光顯微鏡,，也配備了各種對(duì)比度增強(qiáng)模式下的透射光觀察,，如圖1所示。顯微鏡包含一個(gè)三目觀察頭,，耦合到電荷耦合器件（CCD））攝像系統(tǒng),，有兩個(gè)照明源，一個(gè)用于透射光,，另一個(gè)用于觀察觀察（分別是鎢 - 鹵素和汞弧放電）,。該設(shè)計(jì)的顯微鏡可以組合或交替反射光熒光與透射光相位對(duì)比度，微分干涉對(duì)比度（DIC）,，偏振光或霍夫曼調(diào)制對(duì)比度觀察,。

任何熒光顯微鏡的基本特征是提供用于激發(fā)樣本的機(jī)制，其具有選擇性過(guò)濾的照明,，然后使用第二過(guò)濾器分離更弱的熒光發(fā)射,，以在暗的背景上以大的靈敏度形成圖像。在許多實(shí)驗(yàn)中,，生物樣本中的局部探針濃度非常低,，只有一小部分激發(fā)光被熒光物質(zhì)吸收。此外,，在那些能夠吸收一定量照射的熒光團(tuán)中,，發(fā)出二次熒光的百分比甚至更低。得到的熒光發(fā)射亮度水平將比照明的亮度水平低三到六個(gè)數(shù)量級(jí),。從而,，熒光顯微鏡的基本問(wèn)題是產(chǎn)生樣品的高效照明，同時(shí)捕獲與更強(qiáng)烈的照射帶有效分離的弱熒光發(fā)射,。在現(xiàn)代熒光儀器中通過(guò)基于二色分束器的作用和特性協(xié)調(diào)激發(fā)和發(fā)射要求的濾光器的組合來(lái)滿足這些條件,。

圖2概述了在反射光熒光顯微鏡中二色分束器（鏡子）功能背后的原理，其中包含熒光團(tuán)的假想樣品,，該熒光團(tuán)在綠色區(qū)域（550納米）激發(fā)并發(fā)出紅色（620至660納米）波長(zhǎng)的熒光,。可見(jiàn)光譜,。高強(qiáng)度光源以高通量密度（通常覆蓋大部分紫外線和整個(gè)可見(jiàn)光譜）輸出寬范圍的激發(fā)波長(zhǎng),，這些波長(zhǎng)穿過(guò)照明器并首先遇到選擇適當(dāng)激發(fā)波段的濾波器（標(biāo)記為EF; 見(jiàn)圖2（a））。在這種情況下,，濾光器以高效率通過(guò)波長(zhǎng)在510和560納米之間的光,，但也允許其他波長(zhǎng)以更小的程度通過(guò)。激發(fā)光接著到達(dá)二色鏡（圖2中的DM）并被反射到物鏡后孔中以形成照射樣品的錐形照明,。雙色鏡位于光路中,，呈45度角，設(shè)計(jì)用于選擇性地反射490和565納米之間的波長(zhǎng)（如圖3所示）,，同時(shí)傳輸更短和更長(zhǎng)的波長(zhǎng),。

圖3中顯示了用于將激發(fā)光照與圖2中的熒光發(fā)射分開的濾光器組合的透射曲線。激發(fā)濾光片光譜（紅色曲線）在510和560納米之間顯示出高水平的透射率（大約80％）,。中心波長(zhǎng)（CWL）535納米,。二色鏡（黃色曲線）反射激發(fā)光譜區(qū)域中的波長(zhǎng)，同時(shí)以相對(duì)高的效率通過(guò)更高和更低的波長(zhǎng),。注意,，二色鏡像曲線上的百分比透射率對(duì)應(yīng)于100％反射。在490和570納米之間的透射分布中的顯著下降（其表示反射率的峰值）用于反射從激發(fā)濾光器以90度角進(jìn)入樣品的波長(zhǎng)帶,。光學(xué)系列中的后一個(gè)組件,，即發(fā)射或屏障濾光器（白色曲線），透射高于590納米的波長(zhǎng),，這對(duì)應(yīng)于具有黃色,，橙色和紅色的可見(jiàn)光。各種疊加光譜的透射和反射波段之間的邊界被設(shè)計(jì)成盡可能陡峭,，以確保反射和透射波長(zhǎng)幾乎*分離,。在二色鏡光譜中出現(xiàn)正弦上升和下降尖峰的圖案是薄膜沉積過(guò)程的常見(jiàn)效果，稱為響個(gè)不停,。該濾波器組合的性能非常出色,，清楚地證明了薄膜干涉濾波器技術(shù)的快速發(fā)展。

因?yàn)橹挥姓瓗挼墓獗浑p色鏡反射,，所以設(shè)法通過(guò)激發(fā)濾光片的短于490納米且長(zhǎng)于565納米的照射波長(zhǎng)也通過(guò)二色鏡傳輸,，如截止上方的光所示。在圖2（a）中,。注意,，激發(fā)光的反射不是100％有效，因此,，少量綠光通過(guò)二色鏡而不被反射,。另外，并非所有波長(zhǎng)大于565或小于490納米的光都透過(guò)鏡子,。這種光的一小部分被鏡子通過(guò)物鏡反射到樣品上,。

由綠光激發(fā)產(chǎn)生的樣品的熒光發(fā)射（主要是紅色波長(zhǎng)）由物鏡聚集并通過(guò)二色鏡和屏障濾光器（圖2（c）中截止的光線以上）。屏障過(guò)濾器（標(biāo)記為BF在圖2中,，專門設(shè)計(jì)為僅允許波長(zhǎng)大于590納米的光到達(dá)顯微鏡目鏡和/或探測(cè)器,。在用于此任務(wù)時(shí)，屏障濾光器有效地防止從樣本反射的（并且成功地穿過(guò)二色鏡）的激發(fā)光波長(zhǎng)到達(dá)檢測(cè)器,。然而,，從樣品返回的大部分激發(fā)波長(zhǎng)被二色鏡（圖2（c）中的截止光以下的光）反射到激發(fā)濾光器和發(fā)光器,。圖2和3中所示的濾光器配置的凈效應(yīng)是將強(qiáng)度明顯更高的激發(fā)光與更弱的熒光發(fā)射分開。在所有情況下,，如圖所示,，熒光顯微鏡中涉及的濾光片的截止水平不是的，但可以使波長(zhǎng)范圍外的一些光線滲透,。圖2（b）中以圖形方式顯示了整個(gè)事件序列,，其中說(shuō)明了有效反射光熒光顯微鏡所需的光學(xué)路徑和策略濾波器布置。

垂直熒光照明器

現(xiàn)代熒光顯微鏡的核心是通用反射光垂直照明器,，它插在觀察觀察管和攜帶物鏡的物鏡轉(zhuǎn)換器之間,，如圖1和圖4所示。照明器設(shè)計(jì)用于引導(dǎo)高光產(chǎn)生的光 - 通過(guò)首先使光通過(guò)顯微鏡物鏡朝向樣品的方向,，然后使用相同的物鏡捕獲樣品發(fā)出的光,，將強(qiáng)度源置于樣品上。這種類型的照明策略具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn),。顯微鏡物鏡首先作為經(jīng)過(guò)良好校正的聚光器,，然后收集成像熒光發(fā)射，以便傳輸?shù)侥跨R或相機(jī)檢測(cè)系統(tǒng),。因此,，物鏡總是相對(duì)于每個(gè)功能正確對(duì)齊。此外,，由樣本散射或反射的大部分激發(fā)光（在360度角上）遠(yuǎn)離物鏡前透鏡元件,，而不是直接投射到玻璃中，如透射熒光照射的情況,。這種效應(yīng)被稱為正面照明,，特別適用于厚厚的標(biāo)本。后,，被照射的標(biāo)本區(qū)域被限制在被觀察的相同區(qū)域,，并且照明和光收集都可以利用物鏡的全數(shù)值孔徑。

在垂直照明器的遠(yuǎn)端是燈箱（見(jiàn)圖4）,，其包含高強(qiáng)度電弧放電或燈絲基白熾燈光源,。受歡迎的照明光源是高壓100瓦汞弧燈（HBO，通常稱為燃燒器）但是,，氙氣和金屬鹵化物弧光燈,，激光器和鹵化鎢白熾燈也可用于此目的。由光源發(fā)出的光由聚光透鏡系統(tǒng)聚焦,，并沿著平行于桌面并垂直于顯微鏡光軸的照明器內(nèi)部行進(jìn),。圖4所示的發(fā)光器設(shè)計(jì)包含多組件收集器透鏡系統(tǒng)，但也實(shí)施非球面透鏡元件以改善近紅外和紫外區(qū)域中的色差校正,。設(shè)計(jì)用于去除或抑制紅外波長(zhǎng)的熱過(guò)濾器放置在燈箱本身內(nèi)部或鄰近垂直照明器后部的燈箱安裝座,。此外,，一些顯微鏡包含雙頻或多頻激勵(lì)平衡器燈箱附近的系統(tǒng)（見(jiàn)圖4和圖8）選擇性地過(guò)濾激勵(lì)不需要的波長(zhǎng)，以微調(diào)包含在照明器另一端的熒光濾光器組的性能,。

同樣位于垂直照明器中燈箱附近的是一組中性密度濾光片,，可用于調(diào)節(jié)通過(guò)系統(tǒng)的光的總強(qiáng)度并減少熒光褪色或光漂白。這些過(guò)濾器通常安裝在滑塊框架上,，使其能夠在觀察樣品熒光的同時(shí)快速插入光路并從光路中移除。為了建立Köhler照明,，垂直照明器包含一個(gè)可居中的光圈和視場(chǎng)光闌組合,，兩者都有可變的光圈孔徑，決定了場(chǎng)的大小和照明強(qiáng)度,。通過(guò)位于垂直照明器殼體的每個(gè)外側(cè)上的幾對(duì)旋鈕實(shí)現(xiàn)孔徑和場(chǎng)光闌的對(duì)中以及光圈尺寸的調(diào)節(jié),。在某些設(shè)計(jì)中，提供一個(gè)滑塊旋鈕,，從光路中移除整個(gè)光圈組件,，以大化通過(guò)照明器的光量。其他顯微鏡包含固定尺寸的針孔,，安裝在滑塊上,，可插入光路，大大限制照明場(chǎng),，適用于特殊應(yīng)用,，如光漂白后的熒光恢復(fù)（FRAP）調(diào)查。

在垂直照明器光學(xué)系列中的場(chǎng)光闌和光闌之后是場(chǎng)透鏡,，它是擴(kuò)散光并產(chǎn)生足夠的照明場(chǎng)以建立科勒照明所必需的,。在場(chǎng)鏡之后，所有現(xiàn)代垂直照明器都包含一個(gè)光閘（具有手動(dòng)開關(guān)控制）,，當(dāng)沒(méi)有觀察或記錄熒光時(shí),，它阻止強(qiáng)烈的激發(fā)光到達(dá)濾光片組和樣品?？扉T是熒光顯微鏡的一個(gè)關(guān)鍵特征,，因?yàn)闃悠返倪B續(xù)照射可以顯著減少由于光漂白引起的發(fā)射，而高強(qiáng)度光對(duì)于活細(xì)胞是不健康的,。此外,，快門使電弧放電燈保持活動(dòng)狀態(tài)（減輕預(yù)熱時(shí)間），同時(shí)用透射光瞬間檢查標(biāo)本,。熒光顯微鏡通常配備電子快門,，可快速遠(yuǎn)程控制照明。防紫外線護(hù)罩（標(biāo)有圖4中的呼吸遮光罩安裝在照明器外殼的前部,，以保護(hù)操作員在快門打開時(shí)不會(huì)意外泄漏潛在危險(xiǎn)的短波紫外線輻射,。通過(guò)在觀察時(shí)保護(hù)標(biāo)本免受呼出氣體,，護(hù)罩起到雙重作用。

幾種垂直照明器設(shè)計(jì)提供了用于矩形偏振器框架的槽,，其可用于熒光偏振研究,。在大多數(shù)情況下，將偏振器插入場(chǎng)鏡后面的照明光路（遠(yuǎn)離共軛平面）,，但是在光閘之前（見(jiàn)圖4）,。偏振器可以用預(yù)定的透射方位固定到位，或者安裝在齒輪組上,，允許通過(guò)使用指輪改變透射軸的方向,。由于偏振器安裝在滑動(dòng)框架中，因此在不使用時(shí)可以很容易地從光路中移除,。隨附的分析儀（熒光各向異性測(cè)量所需的第二個(gè)偏振器）可以安裝在濾光塊轉(zhuǎn)塔上方的垂直照明器中,，或在專門設(shè)計(jì)的偏光顯微鏡中間管中。輔助管通常能夠插入漸變的旋轉(zhuǎn)偏振器單元,，以確保分析器透射方位相對(duì)于偏振器和顯微鏡光軸的精確定位,。

垂直照明器的后一級(jí)包含一個(gè)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)臺(tái)或滑動(dòng)支架，其中裝有包含熒光濾光器組合的光學(xué)塊,。當(dāng)需要使用特定熒光濾光器組合成像時(shí),，濾光器塊旋轉(zhuǎn)（或滑動(dòng)）到光學(xué)系列中。單個(gè)塊包含一組匹配的激發(fā)和發(fā)射濾光片,，以及二色分光鏡,，所有這些都經(jīng)過(guò)精心定位，以大限度地提高樣品照射和捕獲特定波長(zhǎng)的熒光發(fā)射,。光學(xué)塊轉(zhuǎn)塔和滑塊支架可以裝載三到六個(gè)單獨(dú)的塊,，其中一個(gè)位于光路中，而其他塊在臨時(shí)存儲(chǔ)中旋轉(zhuǎn)或滑出,。當(dāng)觀察用兩個(gè)或更多熒光探針標(biāo)記的樣本時(shí),，這些附件能夠在熒光濾光片組之間快速轉(zhuǎn)換。在配備有熒光照明器的顯微鏡中使用透射照明通過(guò)裝配在轉(zhuǎn)臺(tái)或滑塊支架上的槽中的虛擬光學(xué)塊來(lái)促進(jìn),。虛擬塊阻止激發(fā)發(fā)射（當(dāng)快門打開時(shí)）,，但不包含任何濾光器并允許光從物鏡不受阻礙地通過(guò)觀察管。

在標(biāo)準(zhǔn)模塊化直立顯微鏡中,，垂直照明器位于顯微鏡框架和觀察管之間（見(jiàn)圖1）,。許多制造商提供可插入照明器和目鏡單元之間的中間管，用于偏振器,，DIC棱鏡或其他附件?，F(xiàn)代顯微鏡框架通常是計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)努力的結(jié)果，其導(dǎo)致顯著的減振和增強(qiáng)的人體工程學(xué)特征。合成材料,，如金屬基陶瓷和鋁復(fù)合材料,，可顯著提高框架的靜態(tài)和熱剛性，從而使儀器能夠承受先進(jìn)熒光技術(shù)的嚴(yán)苛要求,，這些技術(shù)需要在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)*消除振動(dòng)用于成像弱熒光發(fā)射,。

Köhler熒光顯微鏡照明

在熒光垂直照明器中，光源被定位成使得細(xì)絲或電弧放電等離子體球位于聚光透鏡的主焦點(diǎn)附近,。在Köhler照明中,，燈聚光透鏡起到顯著增大的輔助光源的作用，以增強(qiáng)整體照明,。Köhler照明的主要要求之一是燈絲或電弧的圖像必須終投射到物鏡的后焦平面上,，在反射光照射的激發(fā)期間，它也是（通常是高數(shù)值孔徑）聚光器的兩倍,。理想情況下，光源應(yīng)填充整個(gè)物鏡孔徑,，以大化輻射強(qiáng)度并產(chǎn)生均勻照射的場(chǎng),。在某些情況下，熱點(diǎn)）,。但是,，由于擴(kuò)散濾光片也會(huì)降低照度，因此應(yīng)盡可能避免使用,。

在反射光Köhler照明（圖5中示意性地示出）中,，光源的圖像被聚光透鏡聚焦到位于垂直照明器中的孔徑光闌膜片上。該光闌與物鏡的后孔和燈弧或燈絲共用共軛平面,，因此確定照射的場(chǎng)孔徑尺寸,。光源，垂直照明器孔徑光闌和物鏡后焦平面（光瞳）一起形成共軛平面的照明組,。與透射光顯微鏡的情況不同,，孔徑光圈和光源被成像到物鏡（充當(dāng)聚光器）后孔徑平面上，而不是物理地位于該位置,。作為此配置的附加好處,，當(dāng)物鏡提供激發(fā)照射或由聚集的熒光發(fā)射形成圖像時(shí)，所有障礙物（例如虹膜光圈）都從光路中移除,。打開或關(guān)閉孔徑光闌用于控制雜散光并調(diào)節(jié)照明的強(qiáng)度（數(shù)值孔徑）而不改變照明場(chǎng)的大小,。在圖像中，孔徑光闌的調(diào)整會(huì)影響亮度和對(duì)比度,。

反射光Köhler照明中的共軛平面的成像或場(chǎng)組由場(chǎng)光闌,，樣品表面和中間圖像平面組成。因此,，當(dāng)場(chǎng)光闌在樣品平面處聚焦時(shí),，光源的圖像顯著地從焦點(diǎn)移除,，以便提供均勻的照明場(chǎng)。視場(chǎng)光闌控制照射場(chǎng)的大小而不影響被觀察區(qū)域的照明強(qiáng)度,。在實(shí)踐中,，場(chǎng)光闌開口尺寸應(yīng)該盡可能小，以便增加圖像對(duì)比度并減少未被直接觀察的區(qū)域中的光漂白程度,。盡管大多數(shù)電弧放電和燈絲光源產(chǎn)生的照明強(qiáng)度不均勻,，但Köhler照明可以均勻照射樣品場(chǎng)。正確配置顯微鏡后,，物鏡的后焦平面*照亮,，從邊緣到邊緣提供均勻明亮的區(qū)域。在理想情況下,，Köhler照明用一組會(huì)聚的波前對(duì)樣本進(jìn)行沐浴,，每個(gè)波前都是由光源上的單獨(dú)點(diǎn)形成的，這些點(diǎn)被成像到聚光器孔徑中,。在正確配置的熒光顯微鏡中,，結(jié)果是的圖像對(duì)比度和分辨率。在理想情況下,，用一組會(huì)聚的波前對(duì)樣本進(jìn)行沐浴,，每個(gè)波前都是由成像到聚光器孔徑的光源上的不同點(diǎn)產(chǎn)生的。在正確配置的熒光顯微鏡中,，結(jié)果是的圖像對(duì)比度和分辨率,。在理想情況下，用一組會(huì)聚的波前對(duì)樣本進(jìn)行沐浴,，每個(gè)波前都是由成像到聚光鏡孔徑的光源上的不同點(diǎn)產(chǎn)生的,。在正確配置的熒光顯微鏡中，結(jié)果是的圖像對(duì)比度和分辨率,。

光源和燈塔

對(duì)于熒光顯微鏡中的嚴(yán)格定量分析,，樣品照射必須在整個(gè)視野中在時(shí)間上和空間上恒定。隨時(shí)間的不穩(wěn)定性通常反映由于電源輸出變化而發(fā)生的燈輻射的波動(dòng),。相反,，在弧光燈中常出現(xiàn)的空間擾動(dòng)來(lái)自稱為閃爍的現(xiàn)象因?yàn)榈入x子體球在電極上來(lái)回移動(dòng)。閃爍通常由電源波動(dòng),，電極電阻的小變化或機(jī)械振動(dòng)產(chǎn)生,。基于燈絲的光源,，例如流行的鹵化鎢燈,，在使用穩(wěn)壓電源的恒定直流電下工作時(shí)非常穩(wěn)定。通常，光源應(yīng)選自其光譜含量,，與物鏡后孔徑區(qū)域相比的燈絲尺寸,，空間和時(shí)間穩(wěn)定性以及場(chǎng)照明的均勻性。還必須特別注意光源的強(qiáng)度,，因?yàn)榧ぐl(fā)濾光器通過(guò)的窄帶波長(zhǎng)僅包括總發(fā)光器輸出的非常小的部分,。

選擇用于熒光顯微鏡的光源的主要考慮因素是與所研究的熒光染料的量子產(chǎn)率和吸收相關(guān)的紫外和可見(jiàn)光光譜分布。此外,，光源必須與捕獲圖像所用探測(cè)器的靈敏度兼容,，無(wú)論是人眼，傳統(tǒng)膠片,，光電倍增管,，增強(qiáng)型視頻管還是數(shù)碼相機(jī)系統(tǒng)。選擇還取決于照明模式,。使用電弧放電或鎢 - 鹵素源滿足寬場(chǎng)熒光顯微鏡要求,，而共聚焦和多光子顯微鏡需要適應(yīng)各種激光系統(tǒng)。鎢和鎢 - 鹵素白熾燈的使用取得了有限的成功,，因?yàn)樗鼈兊拇蟛糠职l(fā)射發(fā)生在光譜的紅色和紅外區(qū)域,，而大多數(shù)熒光團(tuán)被紫外，藍(lán)色和綠色波長(zhǎng)激發(fā),。此外,，電弧放電燈的光輸出比通常用于透射光照射的12伏石英鹵素?zé)袅?0到100倍,。寬視場(chǎng)熒光顯微鏡受歡迎的光源是水銀弧光燈,，它通常包含在基本模型顯微鏡配置中。在某些情況下,，使用氙和金屬鹵化物弧光燈,，但這些通常局限于光譜和強(qiáng)度分布與特定熒光團(tuán)要求相匹配的特殊情況。

汞和氙燈的設(shè)計(jì)類似,，除了燈泡外殼中的物理尺寸和氣體,。汞燈包含兩個(gè)在高壓下密封在石英玻璃燈泡中的電極，該燈泡還含有汽化的元素汞,。當(dāng)電源通電時(shí),，一系列高壓脈沖被發(fā)送到電極，電離一小部分汞氣,，點(diǎn)燃燈,。在燒制之后，電壓降低并且電離氣體用于承載電流并產(chǎn)生在兩個(gè)電極之間形成的等離子體球,。在燈工作期間,，汞的蒸發(fā)在玻璃燈泡內(nèi)產(chǎn)生大量的熱量和壓力,，終產(chǎn)生高強(qiáng)度的光,。汞弧燈產(chǎn)生的光線即使在紫外線和可見(jiàn)光譜范圍內(nèi)連續(xù),，集中在365,400,440,546和580納米的離散波長(zhǎng)。從紫外線到紅外線,，氙燈在整個(gè)光譜范圍內(nèi)具有更均勻的強(qiáng)度分布,。熒光染料的選擇對(duì)于確定熒光顯微鏡的適當(dāng)光源至關(guān)重要。一些熒光探針具有與突出的水銀線重合的激發(fā)帶,，而其他熒光探針受益于氙燈的更均勻分布的照射。

熒光顯微鏡中弧光燈的正確對(duì)準(zhǔn)對(duì)于實(shí)現(xiàn)科勒照明并避免熒光圖像中的明暗區(qū)域至關(guān)重要,。因此,，燈箱的質(zhì)量通?？梢酝ㄟ^(guò)正確的燈對(duì)準(zhǔn)的穩(wěn)定性和用于保持對(duì)準(zhǔn)的調(diào)節(jié)旋鈕的效率來(lái)判斷,。燈座應(yīng)配備燈對(duì)中螺釘,，以使弧形圖像在物鏡后孔中居中,，并且燈箱應(yīng)包含紅外濾光器，以阻擋遠(yuǎn)紅色和紅外線中的長(zhǎng)波長(zhǎng),，從而產(chǎn)生大量的熱量,。一些燈箱設(shè)計(jì)有一個(gè)內(nèi)置的紅色抑制濾波器（例如,，Schott BG38）,，或者用于這種過(guò)濾器的槽,，以消除在某些應(yīng)用中通過(guò)視野看到的帶紅色背景,。此外，燈箱本身不應(yīng)泄漏有害的紫外波長(zhǎng),，并且優(yōu)選地,，如果在操作期間無(wú)意中打開殼體，則應(yīng)該包括開關(guān)以自動(dòng)關(guān)閉燈,。后,，燈箱應(yīng)足夠堅(jiān)固，以承受運(yùn)行期間可能的燃燒器爆炸,。

熒光顯微鏡應(yīng)用的廣泛多樣性通常需要一系列光源以滿足特定熒光團(tuán)和成像條件的要求,。在一些情況下，與超靈敏相機(jī)系統(tǒng)組合可能需要非常低的輻射,，而對(duì)于其他研究,，可能需要強(qiáng)激光激發(fā)以殺死活細(xì)胞或選擇性地漂白熒光團(tuán)。波長(zhǎng)要求通?？缭焦庾V的整個(gè)可見(jiàn)區(qū)域,，以及紫外線和紅外線的部分。由于單個(gè)光源無(wú)法滿足這些多種照明要求,，因此制造商現(xiàn)在提供的適配器可以將兩個(gè)或多個(gè)燈同時(shí)連接到單個(gè)顯微鏡上,。

熒光濾光片組合

如前所述，穿過(guò)垂直照明器的透鏡和光闌的光終遇到容納在光學(xué)塊中的激發(fā)濾光器,，該光學(xué)塊定位成與照明器光路和顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)之間的軸向交叉點(diǎn)重合,。激發(fā)濾光器從燈產(chǎn)生的寬光譜中選擇一個(gè)窄帶波長(zhǎng)，并將它們傳遞到二色鏡,，而二色鏡又將光反射通過(guò)物鏡并照射到樣品上,。在固定目鏡光闌中形成圖像之前，由物鏡聚集的熒光發(fā)射再次通過(guò)二色鏡和發(fā)射或屏障濾光器,。用于在寬場(chǎng)熒光顯微鏡中分離波段的常用濾波器包括彩色玻璃濾光片和干涉薄膜濾光片（或兩者的組合）,。為熒光顯微鏡照明和成像方案中的每個(gè)步驟確定合適的過(guò)濾器可能會(huì)造成混淆,，因?yàn)樯婕按罅窟^(guò)濾器制造商，每個(gè)過(guò)濾器制造商都為熒光文獻(xiàn)提供了專有的字母數(shù)字命名法,。

圖7中示意性地示出了典型熒光激發(fā)塊的解剖結(jié)構(gòu),，以及二色鏡，激發(fā)和屏障濾光器的相關(guān)光譜輪廓,。過(guò)濾塊通常由制造商提供的定制工具組裝,，因此操作員可以互換過(guò)濾器和二色鏡。激發(fā)和屏障過(guò)濾器通過(guò)固定夾,，光學(xué)膠或圓形螺紋安裝座固定到位（參見(jiàn)圖7）,。通常，可以在不打開光學(xué)塊的情況下移除這些濾光器,，因?yàn)樗鼈兾挥谄教雇獗砻嫔系陌枷菘咨戏?。更換二色鏡更加困難，需要*拆卸塊才能進(jìn)入內(nèi)部,。大多數(shù)砌塊部分采用45度對(duì)角接頭鑄造,，通過(guò)保護(hù)內(nèi)部并以適當(dāng)?shù)慕嵌戎味R，可實(shí)現(xiàn)雙重任務(wù),。拆下將塊體部分固定在一起的緊固件（銷釘或小螺釘）后,，可以通過(guò)松開或移動(dòng)固定夾來(lái)取下鏡子，然后小心地將其從塊體中取出,。應(yīng)小心處理二色鏡,，因?yàn)楦缮嫱繉油ǔ２皇鼙Ｗo(hù)且容易劃傷。供應(yīng)顯微鏡公司的幾家過(guò)濾器制造商也提供各種售后過(guò)濾器和二色鏡,，適用于各種熒光應(yīng)用,。拆下將塊體部分固定在一起的緊固件（銷釘或小螺釘）后，可以通過(guò)松開或移動(dòng)固定夾來(lái)取下鏡子,，然后小心地將其從塊體中取出,。應(yīng)小心處理二色鏡，因?yàn)楦缮嫱繉油ǔ２皇鼙Ｗo(hù)且容易劃傷,。供應(yīng)顯微鏡公司的幾家過(guò)濾器制造商也提供各種售后過(guò)濾器和二色鏡,，適用于各種熒光應(yīng)用。拆下將塊體部分固定在一起的緊固件（銷釘或小螺釘）后,，可以通過(guò)松開或移動(dòng)固定夾來(lái)取下鏡子,，然后小心地將其從塊體中取出。應(yīng)小心處理二色鏡,，因?yàn)楦缮嫱繉油ǔ２皇鼙Ｗo(hù)且容易劃傷,。供應(yīng)顯微鏡公司的幾家過(guò)濾器制造商也提供各種售后過(guò)濾器和二色鏡，適用于各種熒光應(yīng)用。

熒光濾光片設(shè)計(jì)包括長(zhǎng)通,，短通（邊緣濾光片）,，以及窄帶,，中帶和寬帶帶濾光片系列,。圖7中示出的光譜示出了幾種常見(jiàn)濾波器輪廓的示例。圖7中的發(fā)射濾波器光譜（藍(lán)色曲線）由具有約575納米的截止波長(zhǎng)的長(zhǎng)通干涉濾波器產(chǎn)生,。較長(zhǎng)的波長(zhǎng)通過(guò)濾波器傳輸,，而較短的波長(zhǎng)被阻擋。來(lái)自同一組的窄帶通激發(fā)濾波器（紅色曲線,，圖7）具有約20納米的帶寬,，而二色鏡（綠色曲線）具有近似中等（455-490納米）的透射區(qū)域和寬帶通濾波器（560） -775納米）。因?yàn)槎R有效地用作綠色中的長(zhǎng)通濾波器,，可見(jiàn)光譜的黃色和紅色區(qū)域（560至700納米）,，在濾光片組中對(duì)其進(jìn)行處理。關(guān)于如何利用熒光團(tuán)吸收和發(fā)射光譜分布來(lái)選擇合適的熒光顯微鏡濾光片組的工作知識(shí)對(duì)于成功實(shí)施該技術(shù)是*的,。

二色鏡（或分束鏡）是熒光顯微鏡濾光器組合中關(guān)鍵的部件,，類似于長(zhǎng)通干涉型濾光器，其制造為具有多層介電材料的公差,。二色鏡和標(biāo)準(zhǔn)干涉濾光器之間的主要區(qū)別在于,，鏡子專門設(shè)計(jì)用于在限定的邊界波長(zhǎng)下進(jìn)行反射和透射，并且必須相對(duì)于顯微鏡和發(fā)光器光軸以45度角操作,。將二色鏡定位成使干涉涂層面向激發(fā)光源,，以便通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)以90度角反射短的激發(fā)波長(zhǎng)到樣品。同一鏡子也必須充當(dāng)透射濾光器,，以將長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光發(fā)射從物鏡傳遞到像平面,。因?yàn)閹缀跞瓷浜痛笸干渲g的波長(zhǎng)過(guò)渡區(qū)域通常僅限于20或30納米，所以二色鏡能夠精確地區(qū)分激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng),。

設(shè)計(jì)熒光濾光器組使得特定激發(fā)波長(zhǎng)帶與二色鏡中的反射區(qū)域精確匹配,。結(jié)果是激發(fā)光通過(guò)顯微鏡有效地反射到樣品上。樣品的熒光發(fā)射必須與二色鏡中的高透射區(qū)域匹配,，以使這些波長(zhǎng)能夠通過(guò)檢測(cè)器,。屏障濾光器在整個(gè)方案中不太重要，但仍然在確保消除散射和反射的激發(fā)波長(zhǎng),，來(lái)自靶以外的探針的熒光和由于自發(fā)熒光引起的一般背景強(qiáng)度方面起重要作用,。創(chuàng)建濾波器組的重要因素是確保傳輸，反射,，所涉濾波器的發(fā)射曲線與相應(yīng)區(qū)域的發(fā)射曲線相匹配,。否則，激發(fā)波長(zhǎng)可能能夠通過(guò)二色鏡并使圖像模糊，或者熒光發(fā)射可能無(wú)意中在鏡子處反射以損害圖像亮度,。

即使在看似完美匹配的濾波器組合中,，也可能發(fā)生各個(gè)濾波器的光譜分布之間的輕微重疊，從而降低性能,。特別值得關(guān)注的是激發(fā)濾光器和二色鏡之間的串?dāng)_,，這使得一些激發(fā)光能夠通過(guò)鏡子并從濾光器塊的壁反射。如上所述,，以高傾斜角度反射的光可以部分地透過(guò)屏障濾光器,，以降低圖像對(duì)比度。這種通過(guò)過(guò)濾器的泄漏稱為滲透或交叉實(shí)際上所有濾波器組合都或多或少地發(fā)生,。過(guò)濾器制造商和顯微鏡公司關(guān)注的主要領(lǐng)域之一是改進(jìn)熒光濾光器組合的設(shè)計(jì),，以降低交叉水平。

熒光濾光片組的幾種配置如圖8所示,。濾光片塊轉(zhuǎn)塔（圖8（a））包含五個(gè)塊,，可以在濾光片組合之間快速轉(zhuǎn)換，同時(shí)研究至少這一數(shù)量的熒光團(tuán),。其中一個(gè)轉(zhuǎn)塔槽通常填充有虛擬光學(xué)塊或留空以用于透射光觀察,。使用激勵(lì)平衡器（圖8（b））微調(diào)激發(fā)光譜以成像雙重或多重標(biāo)記的樣品，其中包含安裝在旋轉(zhuǎn)接頭上的單個(gè)干涉濾光片,。旋轉(zhuǎn)激勵(lì)平衡器的調(diào)節(jié)桿使濾光器的帶通透射區(qū)域移動(dòng)到更短的波長(zhǎng),。從而，當(dāng)平衡器濾光器從零度入射角（垂直于垂直照明器軸）旋轉(zhuǎn)到大旋轉(zhuǎn)角度45度時(shí),，濾光器的帶通區(qū)域可以移動(dòng)25到50納米之間的值,。激發(fā)平衡器可以單獨(dú)使用或串聯(lián)使用以改變觀察下的熒光染料的激發(fā)帶寬，以使發(fā)射強(qiáng)度相等,。該特征使得能夠微調(diào)含有幾種探針的樣本中的熒光團(tuán)強(qiáng)度,，例如，減少來(lái)自一個(gè)探針的熒光發(fā)射,，同時(shí)增加另一個(gè)探針的強(qiáng)度,。激發(fā)平衡器可以單獨(dú)使用或串聯(lián)使用以改變觀察下的熒光染料的激發(fā)帶寬，以使發(fā)射強(qiáng)度相等,。該特征使得能夠微調(diào)含有幾種探針的樣本中的熒光團(tuán)強(qiáng)度,，例如，減少來(lái)自一個(gè)探針的熒光發(fā)射,，同時(shí)增加另一個(gè)探針的強(qiáng)度,。激發(fā)平衡器可以單獨(dú)使用或串聯(lián)使用以改變觀察下的熒光染料的激發(fā)帶寬，以使發(fā)射強(qiáng)度相等,。該特征使得能夠微調(diào)含有幾種探針的樣本中的熒光團(tuán)強(qiáng)度,，例如，減少來(lái)自一個(gè)探針的熒光發(fā)射，同時(shí)增加另一個(gè)探針的強(qiáng)度,。

薄膜涂層技術(shù)的快速發(fā)展可以通過(guò)在單個(gè)干涉濾光器中產(chǎn)生多個(gè)透射峰值以及在二色鏡中制造交錯(cuò)的反射和透射帶的能力來(lái)證明,。當(dāng)適當(dāng)匹配時(shí)，可以組合兩個(gè)多波段濾光片和二色鏡,，以產(chǎn)生多個(gè)熒光濾光片組,，其能夠同時(shí)激發(fā)和觀察幾個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射。過(guò)濾器組可從制造商處獲得,，適用于同一樣品中的兩個(gè),，三個(gè)甚至四個(gè)熒光團(tuán),。多個(gè)濾波器組的主要問(wèn)題是它們的費(fèi)用以及當(dāng)來(lái)自一個(gè)熒光探針的發(fā)射通過(guò)用于另一個(gè)的帶通區(qū)域時(shí)發(fā)生的過(guò)量的交叉或滲透,。在一些樣本（和濾鏡組）中，滲透對(duì)背景強(qiáng)度和圖像對(duì)比度具有顯著影響,。許多研究人員傾向于使用優(yōu)化的濾光片組分別對(duì)每個(gè)熒光團(tuán)成像,，隨后將圖像組合成復(fù)合物。

先進(jìn)的熒光技術(shù)通常需要使用具有單個(gè)二色鏡的多個(gè)激發(fā)和發(fā)射濾光器,。為了便于這些研究,，許多熒光顯微鏡配備了電動(dòng)濾光輪或滑塊，多包含六個(gè)單獨(dú)的濾光片（見(jiàn)圖8（c））,。設(shè)計(jì)用于滑塊的顯微鏡或者在垂直照明器中包含用于插入滑塊的特殊槽,，或者過(guò)濾器滑塊可以代替通常包含中性密度濾光器的滑塊。在一些顯微鏡設(shè)計(jì)中,，垂直發(fā)光器也可以容納發(fā)射滑塊,，或者安裝在發(fā)光器和觀察管之間的輔助中間管以容納滑塊。在直立和倒置顯微鏡中,，包含激發(fā)濾光器的電動(dòng)濾光器單元通常夾在中性密度濾光器和燈箱之間的垂直照明器光學(xué)通路中,。同樣，電動(dòng)發(fā)射濾光片單元在垂直顯微鏡設(shè)計(jì)中放置在垂直照明器和目鏡觀察管之間,，但通常通過(guò)與用于倒置器械的檢測(cè)器相同的外部端口連接,。激勵(lì)和發(fā)射滑塊和電動(dòng)濾光輪對(duì)于使用單個(gè)雙色鏡的雙重和三重激勵(lì)應(yīng)用非常有用。通過(guò)消除在觀察單個(gè)樣本時(shí)重新定位過(guò)濾塊的需要,，這些附件使研究者能夠獲得圖像之間的準(zhǔn)確配準(zhǔn),。

熒光顯微鏡的物鏡

在所有形式的反射光顯微鏡（包括熒光）中，圖像強(qiáng)度是物鏡數(shù)值孔徑和放大率的函數(shù),。實(shí)際上,，強(qiáng)度或亮度（定義為每單位面積和時(shí)間的光子通量）增加了數(shù)值孔徑的四次方，但是僅與放大率的平方成反比：

強(qiáng)度α（NA obj）4 / M 2

其中NA是物鏡數(shù)值孔徑和M.是放大倍數(shù),。從這種關(guān)系中可以明顯看出,，亮的熒光圖像將由具有高數(shù)值孔徑和低放大率（例如0.75 / 20x）的物鏡聚集。例如，數(shù)值孔徑為1.4的60x計(jì)劃復(fù)消色差油浸物鏡理論上會(huì)產(chǎn)生比相同數(shù)值孔徑的100倍物鏡更亮的圖像,，但需要考慮折衷,。增加內(nèi)部透鏡元件的數(shù)量（與高數(shù)值孔徑物鏡一樣）會(huì)產(chǎn)生自發(fā)熒光和來(lái)自內(nèi)部透鏡表面的強(qiáng)度減少反射的相應(yīng)增加。通常,，制造商在其推薦的熒光顯微鏡物鏡中做出高校正因子和增加的光透射之間的折衷,。

一般來(lái)說(shuō)，高數(shù)值孔徑油（1.3至1.4）和水（1.2）浸入計(jì)劃螢石和平面復(fù)消色差物鏡由于其巨大的聚光能力而產(chǎn)生亮的熒光圖像,。這些物鏡表現(xiàn)出優(yōu)異的色彩校正,，因此能夠?qū)⒍喾N熒光發(fā)射波長(zhǎng)聚焦在同一平面內(nèi)。復(fù)消色差和螢石物鏡的透光特性在低至約350納米時(shí)是*的,，這是檢查在紫外區(qū)域中激發(fā)的熒光染料（例如DAPI,，Hoechst，Alexa Fluor-350和AMC）的要求,。盡管有許多內(nèi)部鏡頭,，但這些物鏡是由具有抗反射涂層的低熒光玻璃制成，以大限度地減少背景熒光并產(chǎn)生非常高對(duì)比度的圖像,。

專為特殊應(yīng)用而設(shè)計(jì)的物鏡廣泛用于熒光顯微鏡,。這一類包括高數(shù)值孔徑水浸，多次浸泡（油,，水和甘油）,，以及具有石英透鏡元件的紫外物鏡。對(duì)于活細(xì)胞成像應(yīng)用,，需要具有校正環(huán)的長(zhǎng)工作距離物鏡,，以便通過(guò)厚（0.5-2毫米）培養(yǎng)瓶壁觀察樣品。通過(guò)具有非常長(zhǎng)的焦距（工作距離）的物鏡促進(jìn)厚的試樣深處的檢查,，這些物鏡可以從幾個(gè)制造商處獲得,，用于通過(guò)空氣或水覆蓋眼鏡成像。設(shè)計(jì)用于沒(méi)有蓋玻片的長(zhǎng)工作距離水浸物鏡也具有Teflon前錐,，因此可以將物鏡浸入水溶液中,。對(duì)于在20至30毫米（包括約5毫米水）的工作距離下在水中的紫外激發(fā)（340納米）產(chǎn)生類似的物鏡。對(duì)于相對(duì)較低的放大倍率研究,，建議使用具有*數(shù)值孔徑（0.75至0.95）的20倍水浸物鏡,。雖然非常昂貴,，但這些物鏡在熒光團(tuán)濃度和/或量子產(chǎn)率微不足道的情況下產(chǎn)生極其明亮的圖像。

熒光顯微鏡配件

制造商不斷為其儀器生產(chǎn)有用的附加配件單元，以增加熒光顯微鏡中不斷增長(zhǎng)的成像應(yīng)用的可用選擇,。例如,，在一些顯微鏡上可以選擇矩形場(chǎng)光闌（見(jiàn)圖9）,，它可以限制被照射的樣品區(qū)域,，以提高對(duì)比度并減少光漂白,。模塊化現(xiàn)場(chǎng)光闌代替垂直照明器中的傳統(tǒng)光圈光闌（也是可拆卸模塊），設(shè)計(jì)用于匹配數(shù)字成像傳感器的縱橫比,。矩形場(chǎng)停止提高了科勒照明的效率,，降低了電子傳感器的信噪比。作為額外的好處,，在反卷積研究中使用可編程掃描階段時(shí),，可以調(diào)整圖像矩形大小以與階段步長(zhǎng)一致。針孔類似于矩形場(chǎng)光闌,，可用于需要高度受限照明場(chǎng)的應(yīng)用,。

其他配件包括雙燈外殼適配器，可使兩個(gè)光源（如水銀和氙弧放電燈）同時(shí)連接到垂直照明器,。適用于激發(fā)激光的照明器也可用于全內(nèi)反射熒光（TIRF）,，熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）等應(yīng)用），比率成像和光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn),。此外,，主要制造商提供的大多數(shù)研究級(jí)熒光顯微鏡很容易適應(yīng)各自的激光掃描共聚焦配件,。直立式顯微鏡通過(guò)三目觀察管接受共焦掃描單元,，而倒置儀器可將光束掃描儀連接到顯微鏡框架的側(cè)面或后端口。插入垂直照明器和觀察管之間的雙端口可用于引入額外的光源或?qū)晒庖龑?dǎo)到多于一個(gè)檢測(cè)器,。大多數(shù)這些裝置都配有可選的C型安裝適配器或標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡端口配件,。

設(shè)計(jì)用于電生理學(xué)研究的熒光顯微鏡已變得非常復(fù)雜。許多都配備了專門的減震級(jí),，可以接受各種微操縱器配件,，用于使用熒光，紅外差分干涉對(duì)比（IR-DIC）的實(shí)驗(yàn)）和傳統(tǒng)的明場(chǎng)對(duì)比度增強(qiáng)成像技術(shù),。擺動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)盤可實(shí)現(xiàn)物鏡的快速無(wú)振動(dòng)交換,，以防止在對(duì)活細(xì)胞和組織成像時(shí)干擾標(biāo)本或氣泡的侵入。使用新的高數(shù)值孔徑長(zhǎng)工作距離2x和4x微距鏡頭（物鏡）可以在生物體中進(jìn)行熒光宏觀觀察,，這些鏡頭配備有專門的濾光片組合塊,。此外，一些制造商還提供熒光垂直照明器和濾光片組作為其立體顯微鏡的附件,。

垂直照明器有時(shí)可選擇1.25倍至1.5倍的放大系數(shù)作為選項(xiàng),，但由于引入空放大的固有問(wèn)題，應(yīng)盡可能避免使用輔助鏡頭進(jìn)入熒光圖像,。幾種模塊化垂直照明器設(shè)計(jì)包括用于連接包含在照明器上方的多個(gè)攝像機(jī)端口的分束器模塊以增加成像能力的裝置,。考慮到現(xiàn)在可用于熒光顯微鏡的各種電動(dòng)附件,，包括物鏡轉(zhuǎn)盤,，聚光鏡,，濾光輪和平臺(tái)，研究人員可以獲得比以往更復(fù)雜的成像技術(shù),。制造商在許多復(fù)雜熒光應(yīng)用的配件設(shè)計(jì)中投入了大量精力,，這些應(yīng)用曾經(jīng)只能使用來(lái)自各種來(lái)源的*件構(gòu)建的顯微鏡。隨著熒光顯微鏡成為細(xì)胞生物學(xué),，神經(jīng)生理學(xué)和臨床領(lǐng)域越來(lái)越重要的工具

倒置熒光顯微鏡設(shè)計(jì)

類似版本的垂直熒光照明器可用于倒置（組織培養(yǎng)）顯微鏡支架,。倒置支架還允許反射光熒光和透射光顯微鏡的各種對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)之間的組合或交替。研究級(jí)倒置顯微鏡具有多個(gè)（多六個(gè)）輸入/輸出端口,，通常在框架的每一側(cè)有單個(gè)端口,，以及后部的一個(gè)或兩個(gè)端口（上部和下部）和底部下方的底部端口顯微鏡 在某些型號(hào)中，可以從三個(gè)或更多端口同時(shí)獲得主圖像,，而無(wú)需使用中繼鏡頭,。這種連接水平使得可以使用多個(gè)光源，濾光輪和相機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)雜的熒光分析,。用于倒置顯微鏡的汞和氙燈罩可與標(biāo)準(zhǔn)的多元件或非球面聚光透鏡一起使用,，以提高性能并減少紫外和紅外光譜區(qū)域的像差。此外,，可以使用各種燈箱適配器來(lái)連接多個(gè)照明源,，類似于可用于直立顯微鏡的附件。

圖10中顯示了現(xiàn)代倒置（組織培養(yǎng)）熒光顯微鏡的剖面示意圖,，該顯微鏡配備有Peltier冷卻的CCD圖像傳感器和傳統(tǒng)的35毫米膠片相機(jī)系統(tǒng),。盡管膠片相機(jī)的用途有限，但大多數(shù)倒置顯微鏡仍然在前底座的下部包括用于這些附件的端口,。圖10中所示的顯微鏡可以使用安裝在支柱上的鎢 - 鹵素?zé)粝鋪?lái)執(zhí)行傳統(tǒng)的明場(chǎng)透射照明（具有或不具有對(duì)比度增強(qiáng)）,。汞或氙弧放電燈用于熒光顯微鏡，使用連接到特殊配置的后端口的反射光照明器,?？讖胶蛨?chǎng)光闌，以及中性密度濾光片,，在顯微鏡后部的端口附近進(jìn)入,。在一些倒置顯微鏡模型（未示出）中，包含可對(duì)中隔膜的L形反射光照明器可用于改善對(duì)后輔助端口的訪問(wèn)以用于附加附件,。圖10中通過(guò)顯微鏡的光路以黃色表示透射光,，紫色表示未過(guò)濾弧光燈照明，綠色表示濾光熒光激發(fā),，紅光表示熒光發(fā)射,。

現(xiàn)代倒置顯微鏡框架，如同它們的直立對(duì)應(yīng)物,，是由計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)和制造的復(fù)合材料,，用于結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性,。此外，機(jī)械平臺(tái)部件和電路結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)具有短行程距離和高剛性,，以避免在例如DIC棱鏡插入或物鏡校正環(huán)的調(diào)整等常規(guī)操作中操縱物鏡轉(zhuǎn)向器時(shí)的俯仰和偏航,。先進(jìn)的物鏡轉(zhuǎn)盤架階段能夠在延時(shí)和長(zhǎng)時(shí)間的熒光觀察中實(shí)際消除焦點(diǎn)漂移。標(biāo)準(zhǔn)立式顯微鏡不具備的其他舞臺(tái)選項(xiàng)包括滑動(dòng)和360度旋轉(zhuǎn)舞臺(tái),，玻璃舞臺(tái)插板,，加熱板，培養(yǎng)皿和板支架以及二氧化碳培養(yǎng)箱,。

具有模塊化設(shè)計(jì)的倒置顯微鏡可以容易地配置用于電生理學(xué),，體外受精，顯微操作,，高分辨率DIC,，視頻增強(qiáng)觀察和各種先進(jìn)熒光技術(shù)的研究。這些儀器也很容易適用于共聚焦和多光子顯微鏡,。電動(dòng)配件包括百葉窗,，濾光輪，旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)盤,，熒光塊轉(zhuǎn)盤,，聚焦驅(qū)動(dòng)器和聚光鏡。當(dāng)與高工作距離,，水浸,，紫外激發(fā)和相位對(duì)比的高級(jí)物鏡相結(jié)合時(shí)，所有都具有高度光學(xué)校正,，倒置顯微鏡是進(jìn)行活細(xì)胞和組織熒光研究的理想儀器。

結(jié)論

在熒光顯微鏡中,，樣品內(nèi)局部熒光團(tuán)濃度之間的廣泛變化,，加上從一種熒光染料到另一種熒光染料的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率的差異，顯著影響對(duì)于給定量的激發(fā)強(qiáng)度產(chǎn)生的發(fā)射信號(hào),?？紤]到許多樣本在任何特定視場(chǎng)中僅包含微量的熒光材料，這些組合因子產(chǎn)生的平均熒光發(fā)射水平比激發(fā)強(qiáng)度小4到6個(gè)數(shù)量級(jí),。此外,，還有一些更復(fù)雜的熒光技術(shù)，如原位雜交和共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）,，發(fā)射信號(hào)強(qiáng)度可以比激發(fā)的發(fā)射信號(hào)強(qiáng)度小9到10個(gè)數(shù)量級(jí),。為了補(bǔ)償激發(fā)強(qiáng)度和發(fā)射強(qiáng)度之間的這些大的差異，現(xiàn)代熒光顯微鏡必須能夠在不干擾熒光信號(hào)的情況下將激發(fā)照射衰減超過(guò)十億次,。

熒光顯微鏡的主要特征之一是對(duì)特征波長(zhǎng)吸收和發(fā)射光的熒光探針的高特異性,，導(dǎo)致該技術(shù)能夠在復(fù)雜混合物中以非常低的濃度選擇性地檢測(cè)物鏡物種,。此外，熒光的高靈敏度和空間分辨率使得能夠在顯微鏡的光學(xué)分辨率以下的長(zhǎng)度尺度上精確定位和研究單個(gè)分子,。局部環(huán)境因素也嚴(yán)重影響熒光發(fā)射,，因此該方法是pH，粘度,，離子濃度,，分子距離和取向，膜電位,，疏水性,，電荷分布和擴(kuò)散系數(shù)波動(dòng)的理想探針。熒光的時(shí)間分辨率限于激發(fā)的熒光探針的壽命,，其可以是納秒級(jí),。由于許多生物過(guò)程發(fā)生在這個(gè)時(shí)域，衰變動(dòng)力學(xué)可以揭示有關(guān)細(xì)胞過(guò)程的動(dòng)態(tài)信息,?？偟膩?lái)說(shuō)，這些因素在熒光顯微術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)中至關(guān)重要,。

在過(guò)去十年中,，熒光顯微鏡以驚人的速度發(fā)展，同時(shí)在激光技術(shù),，固態(tài)探測(cè)器,，干涉薄膜制造和基于計(jì)算機(jī)的圖像分析方面同樣迅速發(fā)展。高數(shù)值孔徑水浸物鏡的發(fā)展進(jìn)一步有助于生物現(xiàn)象的研究,，使研究人員能夠在其自然環(huán)境中深入探測(cè)活細(xì)胞,。隨著顯微鏡制造商對(duì)研究界不斷變化的需求做出回應(yīng)，先進(jìn)的熒光儀器和配件的開發(fā)無(wú)疑將繼續(xù)發(fā)展,，它們對(duì)探索自然神秘的終貢獻(xiàn)可能終具有深遠(yuǎn)的意義,。