核酸的定量
核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率高的功能,。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,，單鏈,、雙鏈DNA，以及RNA,。核酸的高吸收峰的吸收波長260 nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig,。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前,，選擇正確的程序,，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液,。然而,，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者頭痛的問題,。靈敏度越高的儀器,，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。
事實(shí)上,，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度,。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng),，都是正常的,。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,，離子濃度等：在測試時(shí),，離子濃度太高，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移如TE,，可大大穩(wěn)定讀數(shù),。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果,。為了大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響,，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值好在0.1-1.5A,。在此范圍內(nèi)混合液不能存在氣泡,，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈,；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致,；不能采用窗口磨損的比色杯,；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。
除了核酸濃度,，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度,，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm,。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8 或者2.0,，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物,，多肽，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0,。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,，A320一般是0,。
蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）
這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白,。選擇Warburg 公式,，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法,，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度,。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì),。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),，一般要消除320nm 的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”,。與測試核酸類似,，要求A280的吸光值至少大于0.1A，的線性范圍在1.0-1.5 之間,。實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí),，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象,。事實(shí)上,，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定,。漂移的原因是因?yàn)閃arburg 公式吸光值換算成濃度,，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變,，濃度就會被放大,，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法,，適合測試較純凈,、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說,，速度快,，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,，如DNA的干擾,；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高,。
比色法蛋白質(zhì)定量
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的混合物,，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),，產(chǎn)生有色物質(zhì),。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度,。
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