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液相色譜儀工作原理及常見問題！
液相色譜儀工作過程
液相色譜儀系統(tǒng)由儲液器,、泵,、進樣器、色譜柱,、檢測器,、記錄儀等幾部分組成。
儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng),，樣品溶液經進樣器進入流動相,，被流動相載入色譜柱(固定相)內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),，在兩相中作相對運動時,，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別,，被分離成單個組分依次從柱內流出,，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀,，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來高效液相色譜儀主要有進樣系統(tǒng),、輸液系統(tǒng),、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),。
1. 進樣系統(tǒng)
液相色譜儀一般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作,，進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的,。
2. 輸液系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括高壓泵,、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47～4.4X10Pa,，流速可調且穩(wěn)定,，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應,，可加快其在柱中的移動速度,，這對提高分辨率、回收樣品,、保持樣品的生物活性等都是有利的,。
流動相貯存器和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變,，包括改變洗脫液的極性,、離子強度、PH值,，或改用競爭性抑制劑或變性劑等,。這就可使各種物質(即使僅有一個基團的差別或是同分異構體)都能獲得有效分離。
3. 分離系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括色譜柱,、連接管和恒溫器等,。
色譜柱一般長度為10～50cm(需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管),，內徑為2～5mm,，由"優(yōu)質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內裝有直徑為5～10μm粒度的固定相(由基質和固定液構成).固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成,，它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去),、多孔性(孔徑可達1000)和比表面積大的特點，加之其表面經過機械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣),，或者用化學法偶聯(lián)各種基因(如磷酸基,、季胺基、羥甲基,、苯基,、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機化合物。
因此,，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性,。例如,，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來,。另外,，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻,、致密狀態(tài),，極易降低渦流擴散效應。
基質粒度小,，微孔淺,，樣品在微孔區(qū)內傳質短。這些對縮小譜帶寬度,、提高分辨率是有益的,。根據(jù)柱效理論分析，基質粒度小,，塔板理論數(shù)N就越大,。這也進一步證明基質粒度小，會提高分辨率的道理,。再者,，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調到60°C，通過改善傳質速度,，縮短分析時間,，就可增加層析柱的效率,。
液相色譜儀常見故障處理
1. 氣泡溢出
流動相內有氣泡,，關閉泵，打開泄壓閥,，打開purg鍵,，清洗脫氣，氣泡不斷從過濾器冒出,，進入流動相,，無論打開purge鍵幾次，都無法清除不斷產生的氣泡,。
原因過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內,，過濾器內部由于霉菌的生長繁殖，形成菌團,，阻塞了過濾器,，緩沖液難以流暢地通過過濾器，空氣在泵的壓力作用下經過濾器進入流動相,。
處理過濾器浸泡于5%硝酸溶液中,，超聲清洗幾分鐘即可;亦可將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小時,，輕輕震蕩幾次，再將過濾器用純水清洗幾次,，打開泄壓閥,，打開purge鍵清洗脫氣，如仍有氣泡不斷從過濾器冒出,，繼續(xù)將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中,，如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出，說明過濾器內部的霉菌菌團已被硝酸破壞,，流動相可以流暢地通過過濾器,。
打開泄壓閥，打開泵,，流速調至1.0～3.0ml/min,，純水沖洗過濾器1小時左右。即可將過濾器清洗干凈,。關閉泄壓閥,，純甲醇沖洗半小時即可。
2. 柱壓高原因
(1) 緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積于柱內;(2) 樣品污染沉積,。處理對于第一種情況先用40～50℃的純水,，低速正向沖洗柱子，待柱壓逐漸下降后,，相應提高流速沖洗,，柱壓大幅度下降后，用常溫純水沖洗,，之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘;對于第二種情況,，由樣品的沉積引起污染的C18柱，和純水反向沖洗柱子,，然后換成甲醇沖洗,，接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定)，再用換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上,。
3. 既無壓力指示,，又無液體流過
(1)泵密封墊圈磨損; (2)大量氣泡進入泵體。處理對于第一種情況,更換密封墊圈;對于第二種情況,在泵作用的同時,，用一個50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣,。
4. 壓力波動大，流量不穩(wěn)定
原因系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物,，使得兩者不能密封,。處理工作中注意觀察流動相的量，保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底,，避免吸入空氣,，流動相要充分脫氣,。如為單向閥和閥座之間夾有異物，拆下單向閥,，放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗,。
5. 出峰不佳，峰分叉
(1)色譜柱被污染; (2)柱頭填料塌陷,。處理對于第一種情況,先用純水反向沖洗柱子,，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定),，再換成甲醇沖洗,，然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上,。
如沖洗后依然出峰不佳,，則考慮第二種情況。對于第二種情況,，擰開柱頭,，檢查柱填料是否硬結或塌陷。去除硬結部分(污染的填料),，裝入新填料,，滴一滴甲醇，填料下陷,，再填,，用與柱內徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊，再填平,，滴甲醇,，再壓緊反復幾次，直至裝滿填平,。柱頭用甲醇沖洗干凈,，擦凈柱外壁的填料,，擰緊柱頭,，用純甲醇沖洗30分鐘以上。
6. 峰面積重復性不佳
(1)進樣閥漏液,?！?2)加樣針不到位?！ ?3)液量不足,。
處理對于第一種情況更換進樣閥墊圈;對于第二種情況保證加樣針插到底，注射樣品溶液后須快速,、平穩(wěn)地從LOAD狀態(tài)轉換到INJECT狀態(tài),，以保證進樣量的準確,。
日常工作中，液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要,，如要注意不要讓空氣進入輸液系統(tǒng)和高壓泵中,，儲液器內的溶液如長時間未用應清洗儲液器并更換溶液，每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈,，防止無機鹽析出或沉積;樣品的前處理也很重要,，任何樣品都要盡可能地去除雜質，溶解,，盡量減少對色譜柱的污染,，以延長色譜柱的使用壽命，同時避免注射過濃的樣品溶液,，以免殘留液在進樣閥內析出固體引起堵塞;色譜柱作好標記,用于不同分析目的的色譜柱不要混用等,。