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液相色譜柱活化,、維護(hù)注意事項(xiàng)！
色譜柱是高效液相色譜儀最主要的部件,，被測物質(zhì)能否被很好的分離和測定,，色譜柱的性能起著決定性的作用,，因此，應(yīng)特別注意色譜柱的活化環(huán)節(jié),，此外色譜柱的日常維護(hù)也很重要,，有效地維護(hù)可以延長色譜柱的使用壽命。
液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱,。正相柱大多以硅膠為柱,，或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團(tuán)的鍵合相硅膠柱;反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì),，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團(tuán)(ODS)稱為C18柱，其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等,。另外還有離子交換柱，GPC柱,，聚合物填料柱等,。
色譜柱的活化
新的液相色譜柱都是保存在一定的保存液中的,，所謂的活化就是替換掉其中的保存液，沖洗掉柱中可能殘留的其他雜質(zhì),，以免影響后續(xù)分析工作。液相色譜柱的活化方法因柱子而異,。
反相色譜柱：使用新的C18柱時(shí),，先用甲醇或乙-腈沖洗20-30個(gè)柱體積，然后用甲醇/乙-腈：水(50:50)沖洗10個(gè)柱體積,，然后再用流動(dòng)相平衡10-30柱體積,。
正相色譜柱：新柱用流動(dòng)相平衡20-30個(gè)柱體積。
離子色譜柱(SAX, SCX)：新柱先用100%甲醇或乙-腈沖洗20個(gè)柱體積,，然后轉(zhuǎn)換到流動(dòng)相平衡,。
不同的色譜柱活化的方法不盡相同，要根據(jù)柱子的種類來選擇活化方法,。另外，要提醒的是,，柱子活化時(shí)不要接檢測器,，避免不必要的污染。
液相色譜柱的維護(hù)
色譜柱的維護(hù)有一定的程序：色譜柱的平衡,、色譜柱的再生,、最后才是色譜柱的維護(hù)。
1,、色譜柱的平衡
反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的,。新柱應(yīng)先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱,。請(qǐng)一定確保您分析樣品所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶,。每天用足夠的時(shí)間以流動(dòng)相來平衡色譜柱,，您就會(huì)在處理問題方面獲得最大的"補(bǔ)償",，而且您的色譜柱的壽命也會(huì)變得更長!
操作步驟：
a. 平衡開始時(shí)將流速緩慢地提高,，用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線(緩沖鹽或離子對(duì)試劑流速如果較低，則需要較長的時(shí)間來平衡)
b. 如果使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽,，應(yīng)注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動(dòng)相平衡; 分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護(hù)柱子,。
2、色譜柱的再生
長期使用的色譜柱，往往柱效會(huì)下降(柱子的理論塔板數(shù)減低),。可以對(duì)色譜柱進(jìn)行再生,，在有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用一個(gè)廉價(jià)的泵進(jìn)行柱子的再生,。
選擇再生方法：
極性固定相(如Si，NH2* ,，DIOL基色譜填料)的再生：正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水。非極性固定相(如反相色譜填料RP-18,，RP-8,，CN等)的再生：水→乙腈→氯仿(或異丙醇)→乙腈→水。
注意：
a. 在對(duì)NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí),，由于NH2可能以銨根離子的形式存在,，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液*流出,。
b. 0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱，如果簡單的用有機(jī)溶劑/水的處理不能夠*洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì),，在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效,。
3、色譜柱的維護(hù)
a.使用預(yù)柱保護(hù)分析柱(硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度);
b.大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2-7.5,，盡量不超過該色譜柱的pH范圍;
c.避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化;
d.流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理;
e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相,，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈,，并保存于甲醇或乙腈中;
f.氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意,，柱及連接管內(nèi)不能長時(shí)間存留此類溶劑,，以避免腐蝕。
液相色譜柱的使用注意事項(xiàng)
液相色譜柱的儲(chǔ)存液無特殊說明,，均為評(píng)價(jià)報(bào)告所示的流動(dòng)相,。在使用前，一定要注意液相色譜柱的儲(chǔ)存液與要分析樣品的流動(dòng)相是否互溶,。在反相色譜中,，如用高濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑，應(yīng)先用10%左右的低濃度的有機(jī)相洗脫劑過渡一下,，否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機(jī)相中很容易析出,，堵塞色譜柱。
1,、流動(dòng)相
流動(dòng)相中所使用的各種有機(jī)溶劑要盡可能使用色譜純,，配流動(dòng)相的水最好是超純水或全玻璃器皿的雙蒸水,。如果將所配得流動(dòng)相再經(jīng)過0.45μm 的濾膜過濾一次則更好,，尤其是含鹽的流動(dòng)相。另外,，裝流動(dòng)相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線過濾器等裝置應(yīng)該定期清洗或更換。
但如果您實(shí)驗(yàn)室中同時(shí)有液質(zhì)與液相的話,，建議液質(zhì)的流動(dòng)相不要輕易過膜,，容易出現(xiàn)交叉污染，或者液質(zhì)使用專門的過膜儀器,。
液相與液質(zhì)混用過膜裝置,，導(dǎo)致三乙胺進(jìn)入質(zhì)譜，響應(yīng)突然下降,。
以常規(guī)硅膠為基質(zhì)的鍵合相填料通常的pH值適用范圍是2.0-8.0。當(dāng)必須要在pH值適用范圍的邊界條件下使用色譜柱時(shí),，每次使用結(jié)束后立即用適合于色譜柱儲(chǔ)存并與所使用的流動(dòng)相互溶的溶劑清洗,，并*置換掉原來所使用的流動(dòng)相。
不同填料的色譜柱,，PH,、柱溫的范圍是不一樣的。
2,、樣品
樣品也要盡可能清潔，可選用樣品過濾器或樣品預(yù)處理柱(spe)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理;若樣品不便處理,，要使用保護(hù)柱,。在用正相色譜法分析樣品時(shí)，所有的溶劑和樣品應(yīng)嚴(yán)格脫水,。
一般樣品高速離心就可以了,，但需注意取上清時(shí)，不要取到下面的沉淀物質(zhì)以及色譜柱前最好加裝 預(yù)柱或在線過濾器,。
3,、反相液相色譜柱色譜柱每天實(shí)驗(yàn)后的保養(yǎng)
使用緩沖液或含鹽的流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)用10%的甲醇/水沖洗30分鐘,，洗掉色譜柱中的鹽,，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子,，應(yīng)該在水中加入10%的甲醇,，防止將填料沖塌陷。
4,、長期保存色譜柱
如色譜柱要長時(shí)間保存,，必須存于合適的溶劑下。對(duì)于反相柱可以儲(chǔ)存于純甲醇或乙腈中,，正相柱可以儲(chǔ)存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲(chǔ)存于水(含防腐劑或柳硫汞)中,，并將購買新色譜柱時(shí)附送的堵頭堵上,。儲(chǔ)存的溫度最好是室溫。
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