口蹄疫病毒通用型FMDV-U熒光PCR檢測試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：口蹄疫病毒通用型（FMDV-U）核酸檢測試劑盒(RT-PCR 熒光探針法)

Name ：Diagnostic Kit for Foot-and-mouth Disease Virus RNA (RT-PCR Fluorescence Probing)

【包裝規(guī)格】48 份/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測的水泡皮及水泡液,、O/P 液等標本中口蹄疫病毒通用型

RNA，適用于口蹄疫病毒通用型感染的輔助診斷,。其檢測結(jié)果僅供參考,。

【檢驗原理】

本試劑盒用一對口蹄疫病毒通用型特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針,，用

一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對口蹄疫病毒通用型 RNA 進行體外擴增檢測,，用于臨床

上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

酶液 50μl×1 管

FMDV-U 反應(yīng)液 1.0ml×1 管

FMDV-U 陽性質(zhì)控品 50μl ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μl ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用,。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,，避光保存、運輸,、反復(fù)凍融少于 5 次，

有效期 12 個月,。

【適用儀器】

ABI 7300,、7500、ABI stepone / stepone plus ,、安捷倫 MX3000P/3005P,、MJ

Opticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺動物,，取水泡皮及水泡液,；待檢活動物，取 O/P 液 2~3mL,。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃,，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月,，標

本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸,，嚴禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

水泡皮樣品：稱取水泡皮 0.05g 于研磨器中研磨,，加入生理鹽水繼續(xù)研磨,，待勻

漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min,，取上清液 100uL 于 1.5mL 滅

菌離心管中,；OP 液或水泡液樣品，直接取 100uL 置于 1.5mL 滅菌離心管中,。

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取

法）,，請按照試劑盒說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性

對照+1 管陽性對照,；樣品每滿 7 份,，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 FMDV-U 反應(yīng)液 酶液

用量 20μl 1μl

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA,、陽性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 4μl，分別加入相應(yīng)的反

應(yīng)管中,，蓋好管蓋,，混勻，短暫離心,。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi),；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息,，反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul,；熒光通道選擇：

檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，請勿

選擇 ROX 參比熒光,。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時間 收集熒光信號

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycle

94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲

線出現(xiàn)整體傾斜時,，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15

范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value

值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),，重新分析結(jié)果,。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,；

可疑：檢測通道 35.0<Ct 值≤37,，建議重復(fù)檢測，如果檢測通道仍為 35.0<Ct

值≤37,，且曲線有明顯的增長曲線,，判定為陽性，否則為陰性,；

陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>37 或無 Ct 值,。

6. 檢測方法的局限性

Ø 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理,、運送以及保存質(zhì)量有關(guān),；

Ø 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果,；

Ø 陽性對照,、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

Ø 病原體在流行過程中基因突變,、重組,，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差異,，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；

Ø 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或

定量檢測不準確的結(jié)果,；

Ø 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段,。

7. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示,；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32,；

以上條件應(yīng)同時滿足,，否則實驗視為無效。

8. 產(chǎn)品性能指標

陰陽性參考品符合率：5 份陽性參考品符合率為 100％,；10 份陰性參考品符合率

為 100％,。

低檢測限：5.0×102copies/ml。

精密度：批內(nèi),、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。

【注意事項】

Ø 所有操作嚴格按照說明書進行,；

Ø 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,，*混勻并短暫離心；

Ø 反應(yīng)液應(yīng)避光保存,；

Ø 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊；

Ø 使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)工作服,；

Ø 樣本處理、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進行,，以免交叉污染；

Ø 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器,；

Ø 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全

通則》進行處理。

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