口蹄疫病毒亞洲1型FMDV-Asia1熒光PCR試劑盒適用于檢測(cè)的水泡皮及水泡液,、O/P液等標(biāo)本中口蹄疫病毒亞洲1型RNA，適用于口蹄疫病毒亞洲1型感染的輔助診斷,。其檢測(cè)結(jié)果僅供參考,。
本試劑盒用一對(duì)口蹄疫病毒亞洲1型特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針,，用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對(duì)口蹄疫病毒亞洲1型RNA進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

口蹄疫病毒亞洲1型FMDV-Asia1熒光PCR試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：口蹄疫病毒亞洲 1 型（FMDV-Asia1）核酸檢測(cè)試劑盒(RT-PCR 熒光探針法)

Name ：Diagnostic Kit for Foot-and-mouth Disease Virus Type Asia I RNA (RT-PCR Fluorescence Probing)

【包裝規(guī)格】48 份/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測(cè)的水泡皮及水泡液,、O/P液等標(biāo)本中口蹄疫病毒亞洲1型RNA,，適用于口蹄疫病毒亞洲1型感染的輔助診斷。其檢測(cè)結(jié)果僅供參考,。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒用一對(duì)口蹄疫病毒亞洲1型特異性引物,，結(jié)合一條特異性熒光探針，

用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對(duì)口蹄疫病毒亞洲1型RNA進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),，用于

臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷,。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

酶液 50μl×1 管

FMDV-Asia1 反應(yīng)液 1.0ml×1 管

FMDV-Asia1 陽性質(zhì)控品 50μl ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μl ×1 管

說明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃,，避光保存,、運(yùn)輸、反復(fù)凍融少于 5 次,，

有效期 12 個(gè)月,。

【適用儀器】

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus ,、安捷倫 MX3000P/3005P,、MJ

Opticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺動(dòng)物,，取水泡皮及水泡液,；待檢活動(dòng)物，取 O/P 液 2~3mL,。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個(gè)月,，標(biāo)

本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

水泡皮樣品：稱取水泡皮 0.05g 于研磨器中研磨,，加入生理鹽水繼續(xù)研磨,，待勻

漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min,，取上清液 100uL 于 1.5mL 滅

菌離心管中,；OP 液或水泡液樣品，直接取 100uL 置于 1.5mL 滅菌離心管中,。

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取

法）,，請(qǐng)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性

對(duì)照+1 管陽性對(duì)照,；樣品每滿 7 份，多配制 1 份),，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 FMDV-Asia1 反應(yīng)液 酶液

用量 20μl 1μl

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA,、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μl,，分別加入相應(yīng)的反

應(yīng)管中,，蓋好管蓋，混勻,，短暫離心,。

4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道,、樣品信息,，反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul；熒光通道選擇：

檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE,，請(qǐng)勿

選擇 ROX 參比熒光,。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間 收集熒光信號(hào)

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycle

94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲

線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15

范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value

值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照),，重新分析結(jié)果,。

6. 檢測(cè)方法的局限性

樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理,、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān),；

樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果,；

陽性對(duì)照,、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果,；

病原體在流行過程中基因突變,、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；

不同的提取方法存在提取效率差異,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

試劑運(yùn)輸,，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,，出現(xiàn)假陰性或

定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；

本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

【注意事項(xiàng)】

所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,；

試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,，*混勻并短暫離心；

反應(yīng)液應(yīng)避光保存,；

反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊；

使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)工作服,；

樣本處理、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,，以免交叉污染；

實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器,；

試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全

通則》進(jìn)行處理,。

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