豬瘟病毒疫苗株（HCLV）熒光PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

【產(chǎn)品名稱(chēng)】

商品名稱(chēng)：豬瘟病毒疫苗株（HCLV）核酸檢測(cè)試劑盒(RT-PCR 熒光探針?lè)?

Name ：Diagnostic Kit for Hog Cholera Lapinized Virus RNA (RT-PCR Fluorescence Probing)

【包裝規(guī)格】48 份/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測(cè)的全血等標(biāo)本中豬瘟病毒疫苗株 RNA,，適用于豬瘟病毒疫

苗株感染的輔助診斷。其檢測(cè)結(jié)果僅供參考,。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒用一對(duì)豬瘟病毒疫苗株特異性引物,，結(jié)合一條特異性熒光探針，用一

步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對(duì)豬瘟病毒疫苗株 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),，用于臨床上對(duì)

可疑感染者的病原學(xué)診斷,。

【試劑組成】

名 稱(chēng) 規(guī) 格

酶液 50μl×1 管

HCLV 反應(yīng)液 1.0ml×1 管

HCLV 陽(yáng)性質(zhì)控品 50μl ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μl ×1 管

說(shuō)明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃,，避光保存,、運(yùn)輸、反復(fù)凍融少于 5 次,，

有效期 12 個(gè)月,。

【適用儀器】

ABI 7300、7500,、ABI stepone / stepone plus ,、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ

Opticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測(cè)儀,。

【標(biāo)本采集】

待檢活豬,，用注射器取血 5mL。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,，長(zhǎng)期保存可置-70℃,，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)

本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,，嚴(yán)禁反復(fù)凍融,。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

全血樣品待血凝后取血清 100uL,，置 1.5mL 離心管中,。

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取

法）,，請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性

對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照,；樣品每滿(mǎn) 7 份,，多配制 1 份),，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 HCLV 反應(yīng)液 酶液

用量 20μl 1μl

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽(yáng)性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 4μl,，分別加入相應(yīng)的反

應(yīng)管中，蓋好管蓋,，混勻,，短暫離心。

4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi),；

4.2設(shè)置好通道,、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul,；熒光通道選擇：

檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請(qǐng)勿

選擇 ROX 參比熒光,。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間 收集熒光信號(hào)

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycle

94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,，當(dāng)曲

線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15

范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),，以及 Threshold 的 Value

值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果,。

5.2結(jié)果判斷

陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35.0,，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線；

可疑：檢測(cè)通道 35.0<Ct 值≤37,，建議重復(fù)檢測(cè),，如果檢測(cè)通道仍為 35.0<Ct

值≤37，且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線,，判定為陽(yáng)性,，否則為陰性；

陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>37 或無(wú) Ct 值,。

6. 檢測(cè)方法的局限性

Ø 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集,、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān),；

Ø 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染,，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；

Ø 陽(yáng)性對(duì)照,、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

Ø 病原體在流行過(guò)程中基因突變,、重組,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；

Ø 試劑運(yùn)輸,，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或

定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果,；

Ø 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無(wú)明顯擴(kuò)增曲線或無(wú) Ct 值顯示,；

陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期,，且 Ct 值≤32；

以上條件應(yīng)同時(shí)滿(mǎn)足,，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

8. 產(chǎn)品性能指標(biāo)

陰陽(yáng)性參考品符合率：5 份陽(yáng)性參考品符合率為 100％,；10 份陰性參考品符合率

為 100％,。

低檢測(cè)限：5.0×102copies/ml。

精密度：批內(nèi),、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。

【注意事項(xiàng)】

Ø 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,；

Ø 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,，*混勻并短暫離心；

Ø 反應(yīng)液應(yīng)避光保存,；

Ø 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊；

Ø 使用一次性吸頭,、一次性手套和各區(qū)工作服,；

Ø 樣本處理、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染,；

Ø 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器,；

Ø 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全

通則》進(jìn)行處理,。

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