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【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：豬傳染性胃腸炎/豬流行性腹瀉病毒/豬 A 組輪狀病毒（TGEV/PEDV/PRV-A）核酸檢測試劑盒（三重?zé)晒?PCR 法）

Name： Transmissible Gastroenteritis Virus ,， Porcine Epidemic Diarrhea Virus and Porcine Rotavirus Type A Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】25T/盒,、50T/盒

【預(yù)期用途】

豬傳染性胃腸炎（TGEV）、豬流行性腹瀉（PEDV）及豬 A 組輪狀病毒（PRV）感染，是豬場常見的病毒性腹瀉，此三種病毒性腹瀉造成了豬場飼料報(bào)酬降低,、藥物和人力增加等重大損失，是危害豬場最嚴(yán)重的   疾病之一,。三者均為高度接觸性腸道疾病,，具有相似的臨床表現(xiàn)及傳染途徑，其鑒別診斷通常需要借助實(shí)驗(yàn)   室診斷技術(shù),。PCR      技術(shù)具有特異性強(qiáng),，敏感度高，可進(jìn)行活體診斷等特點(diǎn),，在實(shí)驗(yàn)室診斷中具有較突出的優(yōu)勢(shì),。本試劑盒適用于檢測標(biāo)本中的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉病毒和豬 A 組輪狀病毒,，適用于豬傳染性胃腸炎,、豬流行性腹瀉病毒、豬 A 組輪狀病毒感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查,。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒用豬傳染性胃腸炎,、豬流行性腹瀉病毒、豬 A 組輪狀病毒的特異性引物和探針,，用一步法熒光RT-PCR 技術(shù)對(duì)豬傳染性胃腸炎,、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測,，用于科研實(shí)驗(yàn)中對(duì)可疑感染者的病原學(xué)檢測,。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

TGEV/PEDV/PRV-A 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

TGEV/PEDV/PRV-A 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃,，避光保存,、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5,，有效期 9 個(gè)月,。

【適用儀器】

ABI 7300 、7500 ,、ABI Stepone/Stepone Plus ,、安捷倫 MX3000P/3005P 、Roche Gene 6000 ,、Roche LC480 ,、 

Bio-RadCFX96 等熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

剖檢豬取腸內(nèi)容物和腸系膜淋巴結(jié),；待檢活豬,，取排泄物，于離心管中。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,，長期保存可置-70℃,，但不能超過 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,，嚴(yán)禁反復(fù)凍融,。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織：分別從腸系膜淋巴結(jié)的 3 個(gè)不同位置取樣，稱取樣品約 1g,，用手術(shù)剪剪碎混勻，再稱取 0.5g 于研磨器中研磨,，加入 1.5mL 生理鹽水繼續(xù)研磨,，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min,，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中,；排泄物：取 0.5g 于 1.5mL 滅菌離心管中，加入 1mL 生理鹽水渦旋振蕩,， 8000rpm 離心 2min,，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2核酸提取

推薦采用公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取,，請(qǐng)按    照試劑說明書進(jìn)行操作,。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽性對(duì)照,；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,，多配制 1 份），每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑TGEV/PEDV/PRV-A 反應(yīng)液酶液

用量20μL1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,，21μL/管,。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取 4μL,，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋,，混勻,， 短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi),；

4.2設(shè)置好通道,、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL,；熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM,、TEXAS RED、CY5， 淬滅通道（Quencher Dye）ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光,，選擇 None 即可,。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)

11cycle42℃20min否

21 cycle95℃10min否

340 cycle94℃15sec否

55℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)）,、stop 值（一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)），以及 Threshold 的 Value 值（上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照）,，重新分析結(jié)果,。

5.2結(jié)果判斷

FAM 通道為豬流行性腹瀉病毒檢測結(jié)果，CY5 通道為豬傳染性胃腸炎病毒檢測結(jié)果,，TEXAS RED 通道為豬 A 組輪狀病毒檢測結(jié)果

陽性：檢測通道 Ct 值≤35,，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38,，建議重復(fù)檢測,，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線,，判定為陽性,，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值,。

6.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示,；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32,； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

7.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集,、處理,、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果,；

3.陽性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果,；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組,，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；

6.試劑運(yùn)輸,，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7.本檢測結(jié)果僅供參考,，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段,。

【注意事項(xiàng)】

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,，完-全混勻并短暫離心,；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊,；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服,；

6.樣本處理,、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,，以免交叉污染；

7.實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器,；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。